多重實時熒光PCR快速檢測轉基因大豆及其加工產品

王鳳軍 葉素丹 包永華 周曉紅 凌 云

(浙江經貿職業技術學院，杭州 310018)

大豆是世界最主要的油料作物，是人類優質蛋白和油脂的主要來源，自20世紀60年代以來，世界大豆生產迅速發展［1］。2016年轉基因大豆的播種面積高達9 140萬公頃，占全球轉基因作物總種植面積的一半［2－3］。從全球單個作物的種植面積來看，2016年轉基因大豆的應用率為78%，高于轉基因棉花、玉米和油菜的應用率。抗蟲/耐除草劑大豆(IntactaTM)在2003—2015年的應用帶來了24億美元的經濟效益，為全球74億人口提供了可獲得的糧食和營養［2］。從世界范圍來看，大豆種植的集中度非常高，主要集中在北美洲的美國、南美洲的巴西和阿根廷、亞洲的和印度等少數幾個國家。以上五個主產國大豆種植面積占全世界的85% ～90%，總占全世界的85% ～90%，單產高出世界平均水平5% ～10%［2］。

由于轉基因大豆產品可能存在潛在的環境污染，食用安全及生態風險，對人類健康和自然環境帶來不利影響，因此，需要加強對轉基因大豆產品的有效監督、監測和管理［4］。歐盟、日本、韓國、挪威等國明確規定轉基因產品的限量標準并制定相應法規實行轉基因產品標簽標識制度。我國農業轉基因生物標識管理辦法也對包括大豆在內的5大類17種市場流通的主要轉基因農產品要求必須加貼標識［5］。而轉基因生物標識管理制度必須以有效的外源基因檢測技術為基礎［6－7］。轉基因大豆產品大量投放市場已經成為不可抗拒的潮流，建立適當的方法對轉基因大豆產品進行檢測就顯得尤為重要。如蔡穎等［8］使用LAMP檢測方法對轉基因大豆A5547－127品系成分進行鑒定;蘆春斌等［9］使用普通定性PCR對廣州市農貿市場中轉基因大豆進行檢測;吳影等［10］使用實時熒光PCR技術對轉基因大豆進行定量篩查檢測和品系鑒定。但這些方法檢測范圍窄，效率低，迫切需要開發高通量的快速轉基因檢測技術。

多重實時熒光PCR技術(Real－time Quantita-tive PCR Detection System)是指在PCR反應體系中加入序列特異性的多個熒光探針，探針根據靶序列設計，5’端含有不同波長的報告熒光基團，3’端含有非熒光的猝滅基團，與擴增的靶序列特異性結合。Taq酶的外切核酸酶活性將探針的熒光報告基團與淬滅基團相分離，發出熒光信號，使熒光信號的積累與擴增產物的形成完全同步。在實驗設計過程中，不同探針可以用不同報告基團(不同顏色的熒光信號)標記，實現在一個反應體系中同時對多個靶標基因的定性、定量檢測，且相互間無信號干擾［11－12］。如Koppel等開發了可同時檢測啟動子和終止子的二重實時熒光PCR篩查檢測轉基因產品［13－14］。本課題組前期也建立了可同時檢測番茄內源基因和三個外源基因的四重實時熒光PCR方法，可實現對轉基因番茄產品的高效準確檢測［15］。

本實驗通過提取樣品核酸，檢索與篩選外源靶標基因，設計與驗證特異性引物及多重熒光探針，優化反應條件和反應體系，分析特異性、重復性和靈敏性等，開發建立了可同時檢測內源基因Lectin和外源基因CaMV35S、nos的多重熒光定量PCR檢測技術。本方法的建立將對大豆及其深加工制品中轉基因成分的全程監測和快速監控，確保食品安全有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因陽性樣品:CNAS T025－24轉基因大豆粉(遼寧出入境檢驗檢疫局技術中心組織的PTCT025能力驗證)，FAPAS GeMSU 56A/56B轉基因玉米粉(英國FAPAS組織GeMSU 56能力驗證)，CNAS T0659－23/79/104/175轉基因大豆粉(沈陽產品質量監督檢驗研究院組織的CNAS T0659能力驗證)，3%Bt11、5%MON810、10%MON863 轉基因玉米標準品和10%Roundup Ready轉基因大豆、轉基因棉花標準品:深圳安萊爾科技公司。

轉基因陰性樣品:CNAS T025－30非轉基因大豆粉(遼寧出入境檢驗檢疫局技術中心組織的PTC－T025能力驗證)、CNAS T0659－74非轉基因大豆粉(沈陽產品質量監督檢驗研究院組織的CNAS T0659能力驗證)。經驗證為轉基因陰性的9份豆腐、5袋豆奶粉、9袋豆奶、9份素雞、1份腐乳、1瓶大豆蛋白粉樣品均購于杭州市農貿市場。

1.2 試劑與設備

基因組DNA提取試劑盒(Koning)和AceTaq?DNA聚合酶(Vazyme)分別購自于杭州百邁生物股份有限公司和南京諾唯贊生物科技公司;探針與引物委托美國Invitrogen公司合成;ABI7500實時熒光定量PCR儀;ND2000C核酸蛋白分析儀。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

稱取干重樣品(如豆奶粉)40 mg或濕重樣品(如豆腐、素雞、腐乳)150 mg，豆奶取1 mL離心后留沉淀物，按照Qiagen(69104)植物DNA提取試劑盒說明書進行操作。大豆蛋白粉使用德國Congen Sure－Food PREP Plant X(S1006)進行提取，加入50 μL滅菌雙重蒸餾水洗脫2次。用核酸蛋白分析儀檢測DNA提取的純度和濃度并計算拷貝數。

1.3.2 引物和探針設計

通過上海交通大學的轉基因數據庫(http://ncmcg.sjtu.edu.cn) 等轉基因數據庫(http://www.cera－gmc.org)，比較分析商品化生產的轉基因大豆外源基因信息。比較分析發現，這些轉基因大豆品種大多采用CaMV35S啟動子和nos終止子為調控元件。選定常用的CaMV35S和nos為靶標外源基因。在NCBI網頁檢索大豆單拷貝內源基因Lectin序列和CaMV35S啟動子和nos終止子，使用Primer Express 3.0軟件設計多重引物和熒光探針。探針分別使用熒光基團VIC、FAM和Cy5作為發光基團，使用BHQ和MGB作為非熒光淬滅基團。在DNAstar軟件上評價引物和探針的特異性，在 BLAST 網頁(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上比對擴增產物的特異性。

1.3.3 單重熒光PCR反應

在200 μL光學PCR反應管中依次加入:滅菌蒸餾水14.75 μL、10 ×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP(10 mmol/L each)0.5 μL、引物(10 μmol/L)0.4 μL、探針(10 μmol/L)0.2 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.25 μL 和DNA模板1 μL，反應混合液在實時熒光PCR儀中進行擴增。反應條件設置為95℃預變性15 s;95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，進行40個循環。定量中設置重復實驗和陰性對照實驗，陰性對照中不加模板DNA，而以滅菌蒸餾水代替，用于檢驗是否存在PCR污染和較高的引物二聚體污染。

1.3.4 多重熒光PCR反應

20 μL多重熒光定量PCR反應體系中包括3組檢測引物和探針，Taq酶，dNTP，基因組DNA等成分(具體見表1)，熒光定量PCR擴增條件同1.3.3。設置三個復孔的重復和非模板空白對照。實驗結果應用ABI 7500 software v2.3進行分析處理。

表1 多重熒光定量PCR的反應混合液組成

1.3.5 重復性和特異性檢測

提取CNAS T0659－104轉基因大豆樣本以及CNAS T0659－74非轉基因大豆樣本基因組DNA，使用上述多重熒光定量PCR體系進行轉基因成分檢測，驗證方法的特異性。

1.3.6 靈敏性檢測

提取10%Roundup Ready轉基因大豆樣本基因組DNA，按照10倍濃度稀釋5個梯度，稀釋介質為基因組DNA提取時所用的洗脫液。根據大豆的單倍體基因組分子質量約為1.15×10－12g。稀釋后標準品每個反應分別為 24 000、2 400、240、24、2.4拷貝。對5個梯度的標準品進行實時熒光定量反應，每個濃度設置3個重復，驗證方法的靈敏性。以拷貝數的自然對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標做內源基因Lectin和外源基因CaMV35S和nos的標準曲線。

1.3.7 樣本檢測

采用大豆轉基因成分多重熒光定量PCR檢測方法分別對大豆深加工產品和市場上購買的流通產品進行檢測。同時對實驗室收集的轉基因玉米、大豆、棉花等轉基因標準品，以及中國合格評定國家認可委員會(CNAS)組織的能力驗證樣品進行檢測，驗證方法的適用性。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA提取結果

按1.3.1方法提取的基因組DNA 260/280 nm OD 比值大多為1.7～1.9，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，完整性好，經測試其含量為190～220 ng/L，純度良好，統一稀釋成100 ng/L，可滿足后續實驗要求。

2.2 引物和探針特異性檢測

按照1.3.2中的方法針對轉基因大豆常用的CaMV35S啟動子和nos終止子、內源基因Lectin各設計2－3對引物和探針，然后測試引物和探針擴增情況，選出特異性好的引物和探針用于后續實驗。篩選的引物和探針信息見表2。

表2 轉基因大豆特異性檢測的引物和探針序列

2.3 特異性檢測結果

圖1 不同基因多重熒光PCR反應的擴增曲線圖

提取轉基因大豆CNAS T0659－104和非轉基因大豆CNAS T0659－74樣本基因組DNA，使用上述多重熒光定量PCR體系進行轉基因成分檢測，驗證方法的特異性。圖1為轉基因大豆CNAS T0659－104和非轉基因大豆CNAS T0659－74多重反應的結果，內源基因Lectin均產生了明顯的S型擴增曲線，Ct值小于臨界值。外源基因CaMV35S和nos在轉基因大豆中檢出，且擴增曲線呈現明顯的S型，而非轉基因大豆中不檢出，空白對照無信號，檢測基因之間無信號干擾，外源基因的反應結果與期望結果一致，表明引物探針的設計及反應體系的設置具有特異性，可用于大豆轉基因成分的篩查檢測。

2.4 重復性和靈敏性檢測

圖2 不同基因多重熒光PCR反應的標準曲線圖

由梯度稀釋的DNA擴增的標準曲線(圖2)，得出 R2為0.992 ～0.996。對 Ct值統計分析(表 3)，同一參照樣品重復間Ct值變異較小，Lectin基因Ct值變化范圍在 19.00～32.90之間，標準偏差在0.066 ～0.477，R2為0.993，擴增效率為 101%;外源基因CaMV35S的 Ct值變化范圍在21.57～36.89，標準偏差在 0.237 ～0.547，R2為 0.992，擴增效率為91%;外源基因nos的 Ct值變化范圍在23.76～38.78，標準偏差在 0.065 ～0.510，R2為 0.996，擴增效率為96%，表明該方法具有較好的重復性和穩定性，使用該多重熒光定量PCR檢測大豆轉基因成分的最低檢測限為每20 μL反應2.4個拷貝，最低定量限為每20 μL反應24個拷貝。

2.5 樣品檢測結果

對市場上購買的流通產品共34個批次進行檢測。同時對實驗室收集的轉基因玉米、大豆、棉花等轉基因標準品，以及中國合格評定國家認可委員會(CNAS)和英國FAPAS分析實驗室組織的能力驗證樣品進行檢測。結果見表4。同時按照標準SN/T 1204—2003中所述的引物和探針以及熒光定量PCR方法對上述檢測結果進行驗證［16］，結果多重熒光PCR方法與標準確定的方法的檢測結果一致，表明本實驗研究開發的多重熒光PCR反應體系對大豆轉基因成分篩查檢測的適用性較高，可用于大豆及其深加工制品的轉基因成分的快速檢測。

表3 轉基因大豆多重熒光定量PCR靈敏性檢測Ct值分析表

表4 多重熒光定量PCR反應對轉基因大豆、玉米、棉花標準品和CNAS/FAPAS能力驗證樣品的篩查檢測結果

3 討論

設計多重熒光PCR的熒光探針最好為同一類型:如同時為Taqman探針或同時為MGB探針、或同時為Beacon探針。但目前商品化的VIC和NED熒光探針僅以MGB標記，故本實驗使用了兩條Taqman探針和一條MGB探針。MGB探針較短(14～20 bp)，容易找到所有排序序列的較短片段的保守區，而且加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達到熒光探針Tm值的要求。

由于目前不同熒光定量PCR儀的原理和提供的檢測光譜范圍的差異，因此在選擇探針的發光基團和淬滅基團時要在所用儀器型號設置的熒光信號范圍內選擇，本實驗使用ABI 7500熒光定量PCR儀，共設置5個檢測通道，有五色光源濾光片結合熒光濾光片組成的濾光系統。本實驗根據發射光譜范圍選擇 FAM(522 nm)標記 CaMV35S，VIC(553 nm)標記 Lectin，Cy5(666 nm)標記 nos，3’端以BHQ或MGB為非熒光淬滅標記。

為了能夠在同一反應管中檢測3個靶標基因，并保持較高的反應效率，需對反應體系和條件進行優化。主要優化的參數有退火溫度、引物和探針濃度、模板濃度以及擴增試劑的用量等，通過退火溫度梯度實驗，確定了該多重熒光定量PCR反應的最佳退火溫度為60℃，通過十字交叉法和熒光標記的強弱與熒光信號之間的關系進行了引物和探針濃度優化，最終確定了最佳引物和探針濃度。

多重熒光定量PCR法融合了PCR的靈敏性和光譜技術定量精確的優點，特異性強、敏感度高，操作方便、快速，整個擴增和產物分析過程均在密封單管內完成。不需電泳和紫外或染色觀察，并通過微機控制，實現了對 PCR擴增產物進行實時動態檢測和自動分析結果。不需要對陽性對照、陰性對照、空白對照和待檢樣本分別進行內外源基因反應管的檢測，可實現一管多檢，提高了檢測的通量性和可操作性。為確保該方法相對于實時熒光PCR，LAMP檢測方法和普通定性PCR檢測方法有較大優越性，各方法對比分析如表5所示。

本實驗建立的多重熒光PCR技術可同時對CaMV35S和nos兩個外源基因進行檢測，為保證方法的準確性，通過了特異性、重復性和靈敏性的驗證，確保了該方法在同時檢測兩個靶標基因時，無熒光信號的相互干擾，不會出現假陽性結果;多重擴增體系中設置了內源基因的檢測，可以判斷核酸提取和擴增反應的有效性，避免出現假陰性反應結果。

表5 多重熒光定量PCR技術、實時熒光PCR技術，LAMP檢測方法和普通定性PCR檢測方法的對比分析

4 結論

通過對比優化實驗，摸索出多重熒光定量PCR檢測的最佳反應體系:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，60℃退火并延伸1 min，40個循環，擴增效率在90%～110%之間。通過梯度標準品稀釋建立的標準曲線相關系數R2≥0.98，確定了最低檢測限為每20 μL反應2.4個拷貝，最低定量限為每20 μL 反應24個拷貝。該多重熒光PCR技術可以實現一管多檢的實際需要，降低試劑成本，縮短檢測時間，為大豆及其深加工產品轉基因成分的快速檢測提供了有效方法，為促進農產品和食品出口提供技術保障。