牦牛病毒性腹瀉病診斷與病毒分離鑒定

樊鳳霞，駱正杰

（1.青海省大通種牛場，西寧 810102；2.國家肉牛體系大通綜合試驗站，西寧 810102）

0 引言

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒感染而引起的一種以腹瀉、繁殖障礙及免疫障礙為主要臨床特征的急性、熱性、高度接觸性、傳染性疾病。由于牛病毒性腹瀉會嚴重影響牛的機體免疫功能，造成牛出現免疫抑制和持續性感染，導致機體免疫力下降，對養殖業造成巨大經濟損失。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病毒分離鑒定主要選擇由大通回族自治縣實驗室保存的牦牛腎傳代細胞，牛病毒性腹瀉病毒陽性血清、陰性血清、牛病毒性腹瀉間接免疫熒光檢測試劑盒3種物品均購自于中國獸醫藥品監察所。

1.2 臨床診斷

結合大通縣某養殖場的實際發病情況，對該養殖場發病牛的臨床癥狀進行認真仔細地觀察，結合養殖場該病的流行情況和患病牛的臨床表現，對該病做出初步診斷。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

采集養殖場某患病牛的鼻腔粘液和糞便，作為臨床實驗室診斷病料，低溫保存帶回實驗室。

1.3.2 病毒分離培養與細胞病變觀察

將從患病養殖場帶回的鼻腔粘液和糞便分別用經過滅菌的生理鹽水充分進行5倍稀釋，使用0.45 um的濾膜進行充分過濾后，除去表面細菌，取0.5 mL濾液接種到牛腎傳代單層細胞中，在5%的二氧化碳培養箱內37 ℃培養，每天觀察細胞的病變情況，連續培養第5天后，收獲病毒，盲傳10代。

1.3.3 病毒毒價測定

將盲傳10代后分離得到的毒株分別進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍稀釋，將各稀釋病毒分別接種到96種細胞培養板培養的牛腎傳代單層細胞中，每個孔接種0.1 mL，每個稀釋度分別接種8個孔，連續培養5 d后，根據各個稀釋度細胞病變孔數計算分離得到的病毒對牛腎傳代細胞的半數感染量。

1.3.4 病毒中和試驗

將盲傳10代分離得到的病毒與等量體積的牛病毒性腹瀉標準陽性血清和標準陰性血清在室溫環境下中和1 h后，分別接種到牛腎傳代單層細胞中，將細胞放置于5%的二氧化碳培養箱內37 ℃恒溫培養5 d，每天觀察細胞的病變情況，觀察分離得到的病毒分別與陽性血清、陰性血清中和作用后是否能引起細胞發生特異性病變，確定陽性血清和陰性血清是否對分離得到的病毒具有中和作用。

1.3.5 間接免疫熒光試驗

將盲傳10代分離得到的病毒接種到牛腎傳代單層細胞中，并按照牛病毒性腹瀉間接免疫熒光檢測試劑盒的說明書嚴格操作，確保整個操作正確[1]。

2 臨床診斷與試驗結果

2.1 臨床診斷

青海省大通回族自治縣某養殖場，共飼養牦牛100余頭，2017年4月13日，養殖場中的2頭2月齡犢牛，突然出現發病狀況，發病初期表現為體溫突然升高到42 ℃以上，精神萎靡不振，采食停止，隨后從鼻腔和眼睛中分泌出漿液性和膿性內容物，鼻鏡糜爛，檢查口腔黏膜存在潰瘍病變，從口腔中呼出惡臭氣體。隨后出現水樣腹瀉癥狀，開始時糞便中會夾雜大量粘液和小氣泡，發病中后期糞便中夾雜大量血液和腸粘膜脫落物，身體逐漸消瘦，病程持續3～4周。在整個發病期間，嘗試使用多種抗生素結合治療，均未取得明顯效果，根據臨床癥狀，初步懷疑是牛病毒性腹瀉[2]。

2.2 病毒分離培養與細胞病變觀察

將采集到的病料妥善處理接種到牛腎傳代單層細胞中后，盲傳到第7代，開始陸續出現病變明顯的細胞，主要表現為接種毒株后72 h內，細胞逐漸萎縮，拉網聚集脫落。病毒盲傳到第10代后，收獲病毒，－80 ℃環境保存。

2.3 分離毒株毒價鑒定

將盲傳到第10代獲得的毒株按照上述要求進行充分稀釋后，將各個稀釋度分別接種到96孔細胞培養板培養的牛腎傳代單層細胞中，細胞病變情況如表1所示。按照Reed-Muench法計算毒株的毒價為10-5.19/0.1 mL。

表1 分離毒株毒價鑒定記錄

2.4 病毒中和試驗

盲傳到第10代獲得的毒株和牛病毒性腹瀉陽性血清作用后接種的牛腎傳代單層細胞未出現任何細胞病變情況，與牛病毒性腹瀉陰性血清作用后接種的牛腎傳代單層細胞，細胞逐步出現萎縮、拉網、聚集、脫落等典型的細胞病變。因此，可以確定牛病毒性腹瀉陽性血清對分離得到的病毒的增殖具有明顯的中和作用。

2.5 熒光免疫試驗

盲傳到第10代獲得的毒株的牛腎傳代單層細胞漿內出現了明顯的特異性綠色熒光病變，而正常的細胞細胞漿內不會出現任何特異性綠色熒光變化。因此，可以確診分離的病毒為牛病毒性腹瀉病毒[3]。

3 結論

牛病毒性腹瀉病毒在臨床和病理變化上與牛冠狀病毒、輪狀病毒較為相似。結合患病牛流行病學特點、臨床癥狀和病理學變化，可以對病情做出初步診斷，但要進一步確診，還需要借助實驗室診斷方法明確病原。經過實驗室診斷和臨床診斷最終確診為牛病毒性腹瀉病毒感染。通過采集發病養殖場患病牛的新鮮病料，帶回實驗室后接種到牛腎傳代單層細胞中，盲傳10代后分離得到了牛病毒性腹瀉病毒。

在進行病毒檢測中，病毒中和試驗一直是應用較為廣泛的檢測方法。間接免疫熒光試驗法是現行獸醫典中規定的獸用生物制品檢測牛病毒性腹瀉病毒外源感染的主要方法。隨著我國科學技術不斷發展，用于檢測該種病毒的試劑盒已經存在，并且已經成熟應用。試劑盒檢測牛病毒性腹瀉具有操作簡單、檢測速度快、干擾小的特點，能快速鑒定牛病毒性腹瀉病毒。因此，此次研究主要采用綜合試驗和間接免疫熒光試驗的方法對病毒進行鑒定，結果可靠穩定。通過分離養殖場的致病原，明確致病原類型，為該養殖場今后疾病的防控提供有效參考。