DJ-1保護多巴胺能神經元抵抗過氧化氫氧化應激損傷的研究

胡霞，陳方方，孔陳蘇

(1.四川省八一康復中心、四川省康復醫院神經內科，四川 成都 611135；2.新疆維吾爾自治區鄯善縣人民醫院醫務部，新疆 鄯善 838200)

帕金森病(PD)是老年人常見的運動障礙。其主要病理特征是紋狀體中多巴胺能神經元的退化和壞死。臨床表現為肌僵直、靜止性震顫等。目前國內外帕金森病的發病機制一直處于探討中，而在臨床治療上也缺乏有效的抗氧化應激以及神經保護治療措施[1-4]。PD形成的重要原因與α-突觸核蛋白的異常聚集相關，這更容易在氧化應激環境中聚集和促進多巴胺能神經元的進行性退化和壞死[5]。DJ-1蛋白參與基因轉錄、信號轉導、維持mRNA的穩定性以及參與抗氧化應激等過程。在對抗氧化應激治療中，氧化應激的敏感性的增加是由于DJ-1基因的缺陷引起的[6-7]。此外，DJ-1基因可保護細胞免受大鼠多巴胺能神經元細胞系和原代多巴胺細胞過氧化氫(H2O2)氧化應激誘導的細胞凋亡[9-10]。本研究自2016年1月至2017年7月建立了用H2O2處理的PC12多巴胺能神經元的體外氧化應激模型，探討 DJ-1對多巴胺能神經元氧化應激損傷的保護作用與機制，為PD的發病機制和治療方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑冷凍高速離心機，購買于Thermo Fisher公司；酶標儀，購買于Bio-rad公司；熒光顯微鏡，購買于Olympus公司；熒光定量PCR儀，購買于Bio-rad公司；蛋白電泳儀，購買于Bio-rad公司。

大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12細胞)及胎牛血清(Gibco)購買于中國科學院上海細胞研究所；H2O2購買于上海遠大公司；DHE超氧陰離子熒光探針購買于碧云天公司； DJ-1抗體、TH蛋白抗體和β-actin抗體購買于Abcom公司；CCK-8試劑盒購買于BBI life sciences公司；RNA提取試劑盒購買于上海杰瑞生物技術有限公司；逆轉錄和定量PCR試劑盒均購買于TAKARA。

1.2PC12細胞培養及誘導分化將 PC12細胞系置于 RPMI1640培養基中(含有10只滅活的小牛血清，青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 U·mL-1， L-谷氨酰胺0.12 g·L-1， NaHCO33 g·L-1)，37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。將100 μg·L-1神經生長因子(NGF)加入PC12細胞培養基中進行分化。隔天更換培養液，培養液中事先加入 NGF，誘導分化進行8 d。形態學鑒定后，將已經分化成多巴胺能神經元細胞的PC12細胞系進行后續實驗。

1.3H2O2誘導的氧化應激損傷模型在96孔板中接種 PC12細胞，處理組分別加入50、100、150 μmol·L-1的H2O2，空白對照組不加H2O2，在1.5 h和3 h后分別采用 CCK-8法檢測 PC12細胞活性。

1.4DJ-1過表達載體的構建DJ-1基因序列由Bioengineering Biotechnology(Shanghai)Co.，Ltd。合成和限制性內切核酸酶KpnI和XbaI設計在序列的兩端。隨后將片段連接到pCDH1-cmv載體上。采用氨芐青霉素用于篩選陽性克隆抽提質粒，進行DNA序列測定，驗證基因序列和表達框是否正確。

1.5細胞內活性氧(ROS)水平檢測處理3 h后，加入用50、100、150 μmol·L-1H2O2處理的PC12細胞培養基，并用PBS洗滌2次。隨后用5 μmol·L-1的DHE染色30 min，DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6PI/Hoechst染色法檢測細胞凋亡在96孔板中接種 PC12細胞，處理組分別加入50、100、150 μmol·L-1的H2O2，空白對照組不加H2O2，反應24 h。PI / Hoechst染色顯微鏡下觀察PC12細胞凋亡，計算細胞凋亡率。

1.7蛋白質免疫印跡法(WesternBlot)檢測使用RIPA裂解物裂解細胞，裂解上清液并使用BCA試劑盒測量蛋白質濃度。通過半干電泳將SDS-PAGE凝膠電泳應用于PVDF膜，并將第一抗體在4 ℃溫育過夜，將第二抗體溫育1 h，然后顯影并暴露。抗體使用稀釋比分別為：DJ-1 1∶1 000，TH蛋白抗體 1∶2 000，β-actin 1∶2 000。

1.8熒光定量PCR用不同濃度的H2O2處理PC12細胞3 h后，提取總RNA，用TAKARA逆轉錄試劑盒將500 ng總RNA逆轉錄成cDNA。稀釋5倍后用熒光定量 PCR檢測。所用PCR引物如為，DJ-1正向引物：5′-GGTCCTACTGCTCTGTTG-3′，DJ-1反向引物：5′-GTTGTGACTTCCA-TACTTCC-3′；Caspase-3正向引物：5′-AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3′，Caspase-3反向引物：5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′；α-synuclein正向引物：5′-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3′，α-synuclein反向引物：5′-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3′；Bax正向引物：5′-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，Bax反向引物：5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3；Bcl-2正向引物：5′-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA-3′，Bcl-2反向引物：5′-GACGGTAGCGACGAGAGAAG-3′；p53正向引物：5′-GTACCGTATGAGCCACCTGAG-3′，p53反向引物：5′-CGTCCCAGAAGATTCCCAC-3′；β-actin (內參)正向引物：5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，β-actin (內參)反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。

1.9統計學方法實驗數據由SPSS 13.0軟件進行統計學分析。通過單因素方差分析(ANOVA)分析組間比較的結果，并通過SNK-q檢驗進行兩組之間的比較。以P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1H2O2對PC12細胞增殖活性的影響分別用不同濃度的H2O2處理PC12細胞1.5 h和3 h，用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性。結果如圖1所示，PC12細胞的活性隨H2O2濃度的升高逐漸降低。當H2O2濃度大于100 μmol·L-1時，細胞活性低到一定水平繼續升高H2O2濃度對細胞活性的影響不大。

注：與0 μmol·L-1的H2O2處理1.5 h組相比較，aP<0.05

圖1H2O2處理對PC12細胞增殖活性影響

2.2H2O2處理對PC12細胞凋亡的影響用不同濃度H2O2處理PC12細胞24 h后，PI結果顯示，PI陽性細胞的隨H2O2濃度的升高而增多，H2O2濃度大于100 μmol·L-1時，超過80%的細胞呈PI陽性，即100 μmol·L-1H2O2可以引起大部分細胞發生凋亡。

2.3H2O2對DJ-1表達的影響TH蛋白是多巴胺合成的限速酶[11]，而PD的病理學特征之一是紋狀體多巴胺含量顯著減少，所以TH蛋白的表達量是PD的一個重要參數。Western blot檢測發現，隨著H2O2處理濃度的升高，TH蛋白表達量逐漸減少(圖2)。

2.4過表達DJ-1對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響用pCDH1-cmv過表達載體表達DJ-1，轉染到PC12細胞中，pCDH1-cmv空載體組作為對照組，過表達DJ-1組作為實驗組。用100 μmol·L-1的H2O2處理PC12細胞24 h，用PI/Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況。結果顯示相對于對照組，DJ-1組細胞的凋亡率降低超過50%，見圖3。

注：與對照組相同H2O2濃度相比較，aP<0.05

圖3DJ-1對H2O2誘導的細胞凋亡的影響(DHE染色×100)

2.5過表達DJ-1對細胞內ROS水平的影響H2O2處理PC12細胞3h，pCDH1-cmv空載體組作為對照組，過表達DJ-1組作為實驗組。細胞內的ROS水平用DHE探針檢測。結果是經過100μmol·L-1H2O2處理后，對照組ROS水平在上升。而在過表達DJ-1后，ROS上升卻受到了抑制，見圖4。

注：與對照組相同H2O2濃度相比較，aP<0.05

圖4DJ-1對H2O2細胞內ROS水平的影響(DHE染色×100)

2.6過表達DJ-1對H2O2中凋亡基因表達的影響

pCDH1-cmv空載體作為對照組，過表達DJ-1作為實驗組，用不同濃度的H2O2處理細胞3 h，并用RT-qPCR檢測相關基因的表達變化。結果顯示，隨著H2O2濃度的升高，α-synuclein的表達逐漸增加。同時凋亡相關基因Bax，p53和caspase-3的表達增加，而Bcl-2的表達減少。這些基因的表達變化也許是細胞出現凋亡的主要原因。過表達DJ-1后，α-synuclein表達升高幅度變小。凋亡基因Bax，p53和caspase-3的表達不再隨H2O2濃度的升高而增加，H2O2對Bcl-2的下調作用也被減弱(圖5)。

3 討論

PD是一種神經退行性疾病，其主要病理特征是紋狀體，尤其是黑質多巴胺能神經元(DA)，它們是退行性缺陷。大量文獻證實，紋狀體中多巴胺及其代謝物的減少是由于TH的喪失引起的，導致一系列病理和臨床癥狀[12]。形態學研究報道了PD患者腦內多巴胺能神經元凋亡的顯著變化[13-14]。目前PD黑質多巴胺能神經元凋亡的一個重要因素被認為是由氧化應激引起的活性氧的增加[15-18]。研究表明，多巴胺類固醇和細胞毒性物質如 H2O2和超氧化物是H2O2對多巴胺神經細胞的損害[19]，在黑質鐵離子催化下產生有毒的羥基受損細胞會使多巴胺能神經元置于氧化應激狀態[20]。DA本身還可以與谷胱甘肽結合形成谷胱甘肽-多巴胺，從而減弱PD患者腦內的抗自由基能力，增強氧化應激損傷作用[21];此外，由氧化應激引起的DA神經元中α-突觸核蛋白的異常修飾和聚集破壞了細胞內DA的自我平衡[22]。DA的氧化產生細胞毒性物質并且增加細胞自身的氧化應激的損害。使得其持久損害神經元[23]。

注：與0 μmol·L-1H2O2處理組相比較，aP<0.05

圖2Western blot檢測H2O2對DJ-1和TH蛋白表達的影響

注：與對照組相同H2O2濃度比較，aP<0.05

圖5RT-qPCR檢測DJ-1對H2O2中凋亡基因表達的影響

DJ-1基因位于人染色體1p36.26.3處，全長是24 kb。有8個外顯子，其中外顯子1A和1B不參與蛋白質的編碼，編碼DJ-1蛋白含有外顯子2-7[24]。研究表明， DJ-1可以控制多個抗凋亡的基因，除此之外，還發現在體內 DJ-1和體外 DJ-1，他們與 p53均相互作用影響， UV暴露條件下，過表達 DJ-1能夠明顯抑制 p53的轉錄活性，這導致 Bax表達降低并且還抑制胱天蛋白酶-3活性，最終導致小鼠神經母細胞瘤細胞的凋亡[25]。另有研究表明， DJ-1在細胞內外均具有與多個目的 RNA結合的能力，不乏包括 PTEN/ PI3 K通路上成員、線粒體基因以及谷胱甘肽代謝基因。在氧化應激狀態下，納摩爾濃度水平的DJ-1即可發揮上述作用，但有致病性的突變會使其失活，從而上述作用被抑制[26]。

在這里，神經生長因子(NGF)用于誘導PC12細胞進入具有長樹突的多巴胺能神經元。建立了H2O2誘導的PDPC12細胞氧化應急損傷模型。結果表明，H2O2可顯著抑制PC12細胞的增殖活性。 DHE染色顯示H2O2處理后 PC12細胞內 ROS水平顯著升高，在長時間的H2O2處理后能夠誘導細胞凋亡，即在H2O2的處理后可以造成 DJ-1蛋白和 TH蛋白的表達下調。過表達DJ-1后，PC12細胞對H2O2的耐受力升高，細胞內的ROS升高受到抑制。DJ-1可以抑制α-突觸核蛋白的表達水平，而p53，Bax和caspase-3的表達水平受到抑制。Bcl-2的表達受到保護，這些功能可以減少細胞凋亡。這些結果表明， DJ-1可以通過調節 p53， Bax， caspase-3和 Bcl-2的表達，調節細胞中的 ROS水平并減弱H2O2誘導的多巴胺神經元中的氧化應激損傷。本研究為PD的發病機制和臨床治療提供了新的靶點。這將帶來PD臨床治療的曙光。

(本文圖3,4見插圖12-1)