香菇多糖對新輔助化療后乳腺癌患者免疫功能及淋巴細胞的影響

魯海燕，張喜平

(內蒙古醫科大學附屬醫院普外科，內蒙古 呼和浩特 010050)

隨著人口老齡化、飲食結構、生活環境的變化以及其他因素的影響，乳腺癌近年來發病率呈明顯上升趨勢，已儼然成為女性患者尤其是老年女性群體最為常見的惡性腫瘤，且有發病年齡年輕化的趨勢[1-2]。腫瘤微環境是指包含內皮細胞、免疫細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞和細胞間基質等在內的相互協同作用，從而利于腫瘤細胞生長、轉移的特殊環境。研究證實，腫瘤微環境在腫瘤的病理生理過程中發揮著決定性的作用[3-5]。腫瘤微環境中的淋巴細胞反映出患者的免疫功能狀態以及對抗腫瘤的能力，研究證實Foxp3+Tregs是乳腺癌患者中無病生存時間和總生存率的獨立預測指標，且與腫瘤分型有關，并能在腫瘤組織內差異性分布，證實腫瘤微環境中免疫細胞與患者預后息息相關，因此可以作為腫瘤治療的重要手段[6-8]。香菇多糖具有免疫調節作用，對固有免疫和獲得性免疫均有調節作用，可以提高機體免疫力[9]。但目前其免疫調節機制尚不明確，在乳腺癌患者中研究也較少，因此本研究通過前瞻性納入接受新輔助化療的乳腺癌患者，探討香菇多糖對此類患者免疫功能以及腫瘤微環境中浸潤淋巴細胞的影響，以求為臨床提供相應的理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料前瞻性納入自2015年1月至2016年10月內蒙古醫科大學附屬醫院收治的乳腺癌患者。入組標準：①明確診斷為乳腺癌；②入組前4周未接受化療或放療；③年齡范圍為18～70歲；④預期壽命≥3月，ECOG評分≤2分；⑤知情并同意此研究。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴重的心、肺、腎、肝臟功能障礙；③合并自身免疫性疾病或長期應用激素；④使用其它免疫調節劑；⑤研究期間放棄治療、失訪、轉院等。根據以上標準，研究期間共入組乳腺癌患者88例，采用隨機、對照、單盲的方法將患者分為觀察組和治療組，每組各44例患者。觀察組年齡(57.53±8.57)歲，年齡范圍為40～68歲；病理分型其中浸潤性導管癌30例，乳頭狀癌6例，單純癌5例，髓樣癌3例；雌激素受體陽性29例，孕激素受體陽性25例，人表皮生長因子-2受體陽性20例；組織分化程度其中高分化的8例，中分化的20例，低分化的11例，不能判別分化程度5例。對照組年齡(58.69±9.35)歲，年齡范圍為43～70歲；病理分型其中浸潤性導管癌28例，乳頭狀癌8例，單純癌6例，髓樣癌2例；雌激素受體陽性27例，孕激素受體陽性23例，人表皮生長因子-2受體陽性21例；組織分化程度其中高分化的7例，中分化的19例，低分化的14例，不能判別分化程度4例。兩組患者治療前一般臨床資料比較均差異無統計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究通過內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，所有患者或其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2治療方法所有患者入院均常規完善乳腺、淋巴結超聲，胸腹部CT等檢查，必要時行核磁共振，骨組織核素掃描等檢查。兩組患者均給予相同新輔助化療方案，每次化療前均常規檢查血常規、肝腎功能、心電圖等檢查以排除化療禁忌。新輔助化療方案為CAF方案化療：療程第1天和第8天靜脈注射環磷酰胺500 mg·m-2， 5-氟尿嘧啶500 mg·m-2，多柔比星50 mg·m-2為療程第1天使用。每21 d為1療程，術前共給予3～4個療程，每2～3療程結束時行影像學檢查評估療效。新輔助化療結束后行改良根治術，圍手術期給予營養、血糖、血壓、內環境、心肺功能支持等對癥治療。觀察組在此基礎上給予香菇多糖(天地欣，南京綠葉制藥有限公司，生產批號Z20080579)治療。用法用量：香菇多糖1 mg+5%葡萄糖注射液250 mL靜脈滴注，1周2次，患者非住院期間在社區衛生院輸注。所有患者外周血免疫細胞檢測期間均未行分子靶向治療。

1.3觀察指標及檢測方法一般臨床資料包括年齡、性別、病理分型、組織分化程度等。腫瘤組織切片后常規HE染色和免疫組化(IHC)染色，雌激素或孕激素≥1%定義為激素受體陽性；人表皮生長因子-2受體檢測首先采用IHC初篩，IHC 0/1+診斷受體陰性，IHC3+診斷為受體陽性；IHC2+患者進一步行熒光原位雜交法(FISH)檢測明確受體基因擴增狀態以明確診斷。主要觀察指標包括：腫瘤組織中淋巴細胞浸潤程度如CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+T細胞比例等；外周血中CD4+T細胞、CD8+T細胞水平；血清白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)濃度。腫瘤組織淋巴細胞浸潤情況：手術中留取腫瘤組織標本，洗凈、剪碎、PBS制成細胞懸液，去碎片和細胞團后取得細胞沉淀，分離淋巴細胞后加入單克隆抗體反應30 min，使用Epics XL型流式細胞儀(Beckman，美國)檢測CD4+和CD8+T細胞。外周血CD4+和CD8+T細胞：治療前及手術前留取外周血標本，使用Epics XL型流式細胞儀(Beckman，美國)檢測患者外周血中CD4+和CD8+T細胞。血清白細胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-10、TGF-β1濃度：治療前及手術前留取外周血標本，離心后將血清凍存于-80 ℃冰箱，后集中采用Elisa法(云克隆，武漢)檢測。

表1 兩組一般資料比較

1.4統計學方法所有數據均采用SPSS 22.0統計軟件完成分析，兩組患者計量資料采用兩獨立樣本t檢驗，組間計量資料采用配對樣本t檢驗。分類資料采用χ2檢驗。P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組腫瘤組織淋巴細胞浸潤水平比較觀察組腫瘤組織微環境CD4+T細胞(21.56%±5.08% 比 23.95%±5.17%,t=2.187,P=0.031 )低于對照組；CD8+T細胞(29.52%±3.51% 比 27.47%±3.68%,t=2.673,P=0.009)高于對照組；CD4+/CD8+T細胞比例(0.72±0.12比 0.86±0.14,t=5.036,P=0.000)亦低于對照組，均差異有統計學意義，見圖1。

圖1 兩組患者腫瘤組織淋巴細胞浸潤水平比較

2.2兩組外周血淋巴細胞水平比較相比于對照組，觀察組治療后外周血CD4+T細胞水平明顯增加；CD4+/CD8+T細胞比例明顯增加。治療后觀察組和對照組外周血CD4+T細胞水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3兩組血清IL-6、IL-10、TGF-β1濃度比較治療前兩組血清IL-6、IL-10、TCG-β1濃度差異無統計學意義(均P>0.05)。相比于對照組，觀察組治療后血清IL-6濃度明顯增高(P=0.002)；IL-10濃度明顯降低(P=0.004)；TGF-β1濃度明顯降低(P=0.024)。治療后觀察組和對照組外周血IL-6濃度均顯著降低，IL-10和TGF-β1濃度均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

近年來越來越多的研究證實，免疫在腫瘤患者的病理生理過程中起到了極為重要的作用，活化腫瘤患者機體免疫功能有可能成為抗腫瘤的有效治療手段[7,10-11]?，F有研究結果已經證實，乳腺癌患者機體存在一定的免疫抑制，且研究表明其抑制程度越嚴重，整體臨床預后越差[12]。乳腺癌腫瘤細胞免疫耐受與腫瘤快速生長和轉移息息相關，也是患者臨床預后惡化的重要因素[13]。細胞免疫在抗腫瘤作用中是最主要的執行者，T淋巴細胞，自然殺傷細胞和巨噬細胞在腫瘤微環境中發揮著主要的抗腫瘤免疫應答功能，而體液免疫通常起到協助作用[14]。在抗腫瘤細胞免疫中，活化的細胞毒性T細胞被認為是最重要的效應細胞，可通過誘導腫瘤細胞凋亡發揮作用，因此也被認為是人體對抗腫瘤的防御最前線。細胞毒性T淋巴細胞主要包括CD4+和CD8+T淋巴細胞，CD8+T細胞為主要效應執行細胞但其激活又依賴于CD4+T細胞所分泌的Th細胞因子[15]。白海亞和馬秀芬[16]研究發現CAF新輔助化療方案可以有效提高外周血CD3+、CD4+T細胞以及自然殺傷細胞數量，降低CD8+T細胞數量，增加CD4+/CD8+比例，與本研究結果基本一致，提示有效的新輔助化療方案在抑制腫瘤增殖同時可以改善患者免疫功能。

表2 兩組患者外周血淋巴細胞水平比較

注:與治療前對比，aP<0.05

表3 兩組患者外周血IL-6、IL-10、TGF-β1水平比較

注:與治療前對比，aP<0.05

此外，生物調節劑也是活化機體免疫功能從而發揮抗腫瘤作用的重要治療手段之一。香菇多糖是指從優質香菇子實體中提取出來的一種多聚葡糖，具有很強免疫調節能力和抗腫瘤活性，還具有抗氧化、降血脂、抗病毒等多種藥理功能，近年來在臨床中得到廣泛應用[17]。向冬晴和洛若愚發現香菇多糖可以有效改善Ⅳ期宮頸癌化療患者T淋巴細胞免疫功能，提高化療效果并減輕化療不良反應[18]。龍愛娥[19]也發現，香菇多糖可以增強老年卵巢癌患者中化療效果，并可以抑制實體瘤的生長和有助于控制惡性腹水。本研究結果發現香菇多糖可以有效降低腫瘤組織微環境中CD4+T細胞，同時上調CD8+T細胞比例，CD4+T細胞在腫瘤微環境中主要分化為調節性T細胞，而抑制免疫系統對機體的殺傷作用，CD8+T細胞主要分化為細胞毒性T細胞，而殺傷腫瘤細胞，香菇多糖通過降低CD4+T細胞、提高CD+T細胞，進而增強對腫瘤細胞的殺傷作用。

外周血中CD4+T細胞可根據其分泌細胞因子的不同分為Th1和Th2細胞，研究證實IL-6因子可刺激其向Th1細胞方向分化，而IL-10因子則刺激其向Th2方向分化[20-23]。當Th1細胞下調而Th2上調，即所謂的Th1/Th2漂移往往會導致機體整體免疫功能下降，而Th1細胞具有抗腫瘤作用，因此也會降低機體抗腫瘤作用[24]。本研究結果發現香菇多糖可以有效降低血清IL-10和TGF-β1濃度，提高IL-6濃度，同時可以提高外周血CD4+T細胞水平和CD4+/CD8+細胞比例。TGF-β1可以調節細胞表型，抑制免疫細胞增殖、淋巴細胞分化和細胞因子差生，在細胞的生長、分化和免疫功能中具有重要的調節作用[25]，表明香菇多糖可以有效促進乳腺癌患者細胞免疫向Th1漂移，增強機體對腫瘤細胞的殺傷作用。

綜上所述，香菇多糖可以有效改善乳腺癌患者機體免疫功能，調節腫瘤組織中浸潤淋巴細胞免疫狀態，但目前關于香菇多糖的抗腫瘤機制尚不明確，且目前研究多為單中心，小樣本觀察性研究，其在腫瘤中所發揮的確切作用仍需進一步深入研究。