桂枝加芍藥湯顆粒指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法研究

李明 李蕊 張佳諾 付靜

摘要 目的：探討桂枝加芍藥湯顆粒指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法。方法：采用島津高效液相色譜儀（LC-2010A），以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)標(biāo)志性成分進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：建立了桂枝加芍藥湯指紋圖譜、標(biāo)定了5個(gè)共有峰，指認(rèn)其中3個(gè)峰并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)論：本研究所建立的指紋圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定方法能較好地評(píng)價(jià)桂枝加芍藥湯顆粒的質(zhì)量，并可提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為保證產(chǎn)品質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 桂枝加芍藥湯；HPLC指紋圖譜；芍藥苷

桂枝加芍藥湯出自《傷寒論》，常用于施治脾陰虧損、腸道失潤(rùn)所致便秘、腹脹滿、口唇干燥的老年習(xí)慣性便秘患者^[1]。本方由桂枝、白芍、生姜、大棗、炙甘草組成。方中重用陰柔之芍藥滋養(yǎng)脾陰，復(fù)用味甘之炙甘草、大棗佐芍藥補(bǔ)益脾陰^[2]。方中用桂枝、生姜等陽藥是為脾陰不足、運(yùn)化失職、氣機(jī)壅遏所致之腹脹滿而設(shè)。如此配伍，動(dòng)靜結(jié)合，共奏滋養(yǎng)脾陰、調(diào)暢氣機(jī)之功，則斯癥愈矣。桂枝加芍藥湯作為中藥傳統(tǒng)經(jīng)典方已經(jīng)經(jīng)過了長(zhǎng)期的臨床使用，不僅具有療效確切以及不良反應(yīng)較少的優(yōu)勢(shì)，而且來源于傳統(tǒng)，更突出了中醫(yī)藥特色。但是通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，未能檢索到對(duì)桂枝加芍藥湯質(zhì)量控制的方法。桂枝加芍湯中活性成分復(fù)雜多樣，為彌補(bǔ)質(zhì)量評(píng)價(jià)的不足，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了桂枝加芍湯顆粒的指紋圖譜，并同時(shí)對(duì)其中3種活性成分進(jìn)行控制，從而為深入研究桂枝加芍湯顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍基礎(chǔ)提供了有效的分析手段，為經(jīng)典名方的開發(fā)提供參考依據(jù)。

材料

儀器：島津高效液相色譜儀（LC-2010A），KQ-3000DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MettlerToledo AL104電子天平（瑞士梅特勒一托利多公司，精度：0.001 g），Mettler ToledoXP26電子天平（瑞士梅特勒一托利多公司，精密度：0.01 mg）。

試藥：乙腈（色譜純，411瓶飛世爾批號(hào)：146971），水為屈臣氏蒸餾水（4.5 L/瓶，廣州屈臣氏食品飲料有限公司北京飲料分公司），磷酸為分析純（500 mL/瓶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141104）。桂枝加芍藥湯顆粒南北京康仁堂藥業(yè)有限公司自制^[3-5]；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201640，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘草苷（批號(hào)：111610-201106購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201116，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

方法與結(jié)果

色譜條件：①色譜柱：美國(guó)安捷倫科技有限公司Agilent C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）；檢則波長(zhǎng)267 nm，流速1 mL/min；②柱溫：25℃；進(jìn)樣量10 μL；③流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）采用下表梯度洗脫^[6]。見表1，進(jìn)樣量10 μL，色譜圖，見圖1。

供試品溶液的制備：取桂枝加芍藥湯顆粒約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加蒸餾水50 mL，稱定重量，超聲處理15 min，使溶解，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品制備：制備缺白芍、缺炙甘草陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷適量，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷60μg；精密稱取甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷20μ斗g、含甘草酸銨0.2 mg的混合對(duì)照品，即得。

方法學(xué)考察^[7，8]：①精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（參比峰為甘草苷）的RSD均<3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。②穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定。③重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批桂枝加芍藥湯顆粒6份，按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3%表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

指紋圖譜建立及相似度分析：桂枝加芍藥湯顆粒的HPLC指紋圖譜的建立：取10批桂枝加芍藥湯顆粒樣品，分別按供試品溶液的制備和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜。因甘草苷峰面積相對(duì)加大且穩(wěn)定，故以其為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間，10批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.5%符合指紋圖譜的要求。運(yùn)用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”對(duì)10批樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，設(shè)定樣品1為參照?qǐng)D譜。選取9個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，見圖2。匹配后的10批樣品譜圖見圖3，然后進(jìn)行各樣品相似度評(píng)價(jià)，樣品1～10的相似度分別為0.987、0.978、 0.987、 0.988、 0.994、 0.978、0.979、0.981、0.979、0.971。10批桂枝加芍藥湯顆粒指紋圖譜相似度均>0.90，符合指紋圖譜要求。

含量測(cè)定方法與結(jié)果^[9]

色譜條件：按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以3種對(duì)照品計(jì)算理論塔板數(shù)>5 000，分離度> 1.5。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷適量，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷60 μg；精密稱取甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，加70%乙醇制成沒1 mL含甘草苷20μg、含甘草酸銨0.2 mg的混合對(duì)照品，即得。

對(duì)照品溶液的制備：取桂枝加芍藥湯顆粒約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加蒸餾水50 mL，稱定重量，超聲處理15 min，使溶解，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

線性范圍的考察：精密稱取芍藥苷對(duì)照品12.18 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定溶至刻度，搖勻。分別吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL溶液置10 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，即得。取芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得芍藥苷的回歸方程y=14 011x+14 883（R²=0.999 9） （R²=0.999 9），表明芍藥苷0.122～ 1.218μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密稱取甘草苷、10.08 mg甘草酸銨對(duì)照品10.27 mg，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇使溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL溶液置10 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。取甘草苷、甘草酸銨混合對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得甘草苷的回歸方程為y=2E+ 06x-3975.9（R²=0.9999），表明甘草苷在0.202～ 4.032μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。求得甘草酸銨的回歸方程y=533487x+8668.2（R²=0.9995），表明甘草酸銨在0.201～ 4.025μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖4～6。

準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：精密稱取桂枝加芍藥湯顆粒6份，每份0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加水適量，超聲溶解后，加入濃度為1.392 0 mg/mL的芍藥苷、0.182 6mg/mL甘草苷、0.426 4 mg/mL的甘草酸胺混合對(duì)照品溶液5 mL，加水定容至50 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定芍藥苷、肉桂酸、甘草苷的含量，并計(jì)算回收率，芍藥苷平均回收率為104.1%，RSD為0.39%，甘草苷平均回收率為100.12%，RSD為2.72%，甘草酸銨平均回收率為100.45%，RSD為1.97%，回收率符合相關(guān)要求。見表2。

專屬性實(shí)驗(yàn)：將2.3項(xiàng)所獲得的陰性供試品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果無陰性干擾，故本方法專屬性較好，見圖7。

樣品測(cè)定：精密稱取10批桂枝加芍藥湯顆粒，分別按2.2項(xiàng)下制備供試品，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，見表3。

討論

指紋圖譜與一測(cè)多評(píng)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)：由于桂枝加芍藥湯顆粒成分復(fù)雜多樣，目前還沒有針對(duì)桂枝加芍藥湯相關(guān)的質(zhì)量控制方法出現(xiàn)，故本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫對(duì)桂枝加芍藥湯顆粒中芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨含量進(jìn)行測(cè)定，并同時(shí)建立了指紋圖譜的研究方法。將指紋圖譜技術(shù)與多指標(biāo)成分定量技術(shù)相結(jié)合，建立了桂枝加芍藥湯配方顆粒的質(zhì)量控制方法。

定量指標(biāo)的選擇：桂枝加芍藥湯中白芍養(yǎng)營(yíng)陰，緩肝急，止腹痛。炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。故本研究選取其中相對(duì)穩(wěn)定的芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨作為質(zhì)量控制成分；適合對(duì)桂枝加芍藥湯顆粒質(zhì)量進(jìn)行完整表達(dá)。

色譜條件的選擇：本實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)，選擇峰強(qiáng)度及分離度相對(duì)較好的267 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，通過實(shí)驗(yàn)考察將乙腈-0.1%磷酸溶液作為梯度洗脫流動(dòng)相，得到的色譜峰分離效果好，樣品獲得了合適的保留值，通過方法學(xué)的驗(yàn)證，所得檢測(cè)結(jié)果RSD值均符合要求，故以上述建立的指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分定量方法及樣品處理?xiàng)l件對(duì)桂枝加芍藥湯顆粒進(jìn)行指紋圖譜比對(duì)及定量分析是可行的。

參考文獻(xiàn)

[1]高鳳霞.對(duì)桂枝加芍藥湯和桂枝加大黃湯的功用分析[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2010，20（4）：455-456.

[2]李飛.方劑學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社.2015.

[3]尹蕊.黃芪桂枝五物湯的提取工藝研究[J].中國(guó)藥學(xué)報(bào)，2014，42（3）：76-78.

[4]陳永祥.正交試驗(yàn)優(yōu)選黃芪桂枝五物湯的水提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（2）：56-58.

[5]陳瑩蓉.桂枝湯類方化學(xué)成分含量研究[J].中成藥，2010，32（6）：996-1000.

[6]陳永祥.黃芪桂枝五物湯顆粒的藥學(xué)研究[D].河南中醫(yī)藥學(xué)院，2012.

[7]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)司.中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定性、對(duì)照品研究的技術(shù)要求[J].中藥新藥與臨床藥理.1999，10（5）：314-318.

[8]尹睿卓，王嘉仡，包永睿，等.山綠茶降壓指紋圖譜及一測(cè)多評(píng)法多指標(biāo)成分定量研究[J].中國(guó)新藥雜志，2015，24（15）：132-137.

[9]孟憲生，艾立，羅國(guó)安，等.基于腰痛寧指紋圖譜多指標(biāo)成分定量方法研究[J].中成藥，2009，31（5）：657-659.