香荔核多糖超聲波輔助提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及抗氧化性研究

李珊，梁儉，馮群，劉真珍

（1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣西百色533000；2.百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣西百色533000）

荔枝，因楊貴妃喜食而聞名天下，原產(chǎn)我國(guó)南方，廣西地區(qū)也有大面積種植。每年的六至七月是荔枝集中上市的季節(jié)，其中的香荔，果肉色白溫潤(rùn)，質(zhì)脆清甜，香氣濃郁，尤受消費(fèi)者的喜愛(ài)。荔枝富含多種人體必需的氨基酸及微量元素[1]，不僅可以鮮食還可入藥，據(jù)中醫(yī)記載，荔枝，性溫和，果肉安神溫中、理氣補(bǔ)血、健脾益心[2]。荔枝核則是人們食用荔枝之后的剩余物。香荔的核較大，占據(jù)荔枝總重的近四分之一。目前荔枝核的利用率極低，少部分用于積肥或燃料，大部分則以垃圾形式直接舍棄。

荔枝核在藥理方面與荔枝肉有相似的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)亦證實(shí)，荔枝核中含有豐富的多糖、多酚及黃酮等天然化合物[3-5]。多糖是目前研究較多的一類(lèi)天然有機(jī)化合物，具有降血糖、降血脂、抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力等重要的生理活性[6-10]，被稱(chēng)為生命活動(dòng)中的“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”，是保健類(lèi)食品及藥物的重要來(lái)源，如已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的菊粉（菊芋多糖）[11]。因此，從荔枝核中提取多糖，變廢為寶，實(shí)現(xiàn)荔枝的綜合開(kāi)發(fā)利用，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多糖的提取方法較多，為了進(jìn)一步提高提取效率，在普通提取方式的基礎(chǔ)上增加了超聲波輔助、微波輔助、酶解等方法[12-15]。其中，超聲波輔助提取可以在不破壞多糖結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的前提下明顯縮短提取時(shí)間[16-17]。因此，本文采用超聲波輔助熱水浸提法提取香荔核中的多糖，響應(yīng)面法優(yōu)化，并對(duì)多糖的生物活性進(jìn)行體外測(cè)試，從而為香荔核的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

荔枝（香荔）：百色市右江區(qū)城西大型農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；三氯乙酸、鐵氰化鉀、葡萄糖、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷（分析純）：麥克林生化試劑有限公司；乙醇、濃硫酸、苯酚、水楊酸、過(guò)氧化氫、濃鹽酸、磷酸、三氯化鐵（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-202KDB）：超聲波儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度儀（UV-2800）：上海美普達(dá)儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-B）：常州國(guó)華電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-1）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

香荔去皮去肉取核，60℃干燥至恒重。粉碎，過(guò)60目篩，收集荔枝核粉末樣品于自封袋中，置于冰箱保鮮格中避光保存，備用[18]。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖基準(zhǔn)物干燥至恒重，精準(zhǔn)配制0.500 0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，定容至 100 mL，配制 10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/mL 系列待測(cè)溶液。準(zhǔn)確移取上述不同濃度的葡萄糖待測(cè)液各1.00 mL至干燥的試管中，依次加入蒸餾水2.00 mL、5.0%苯酚溶液1.50 mL、98%濃硫酸7.50 mL，混合均勻后40℃恒溫反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，于491 nm處測(cè)定體系吸光度。以吸光度A對(duì)葡萄糖濃度c（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=0.0139 3c+2.300 × 10-3，R2=0.999 8。

1.2.3 多糖的提取及測(cè)定

在干凈的圓底燒瓶中按一定比例加入香荔核粉末樣品及蒸餾水，置于超聲波提取器中提取，反復(fù)3次。合并提取液，Sevag法去蛋白，過(guò)濾。濃縮，殘液離心，取上清液定容至100 mL，備用。如1.2.2所示測(cè)定體系吸光度，計(jì)算多糖含量，求取多糖提取率[19-21]。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取香荔核粉末樣品1.000g，執(zhí)行1.2.3所示多糖提取流程，固定其它因素及水平：液料比25∶1（mL/g），超聲時(shí)間20 min，超聲功率800 W，考察不同溫度40、50、60、70、80、90 ℃對(duì)多糖提取效果的影響情況[22-24]；固定其它因素及水平：提取溫度50℃，超聲時(shí)間20 min，超聲功率 800 W，考察不同液料比 10 ∶1、15∶1、20 ∶1、25∶1、30 ∶1、35∶1（mL/g）對(duì)多糖提取效果的影響情況；固定其它因素及水平：液料比25∶1（mL/g），提取溫度50℃，提取時(shí)間20 min，考察不同超聲功率400、500、600、700、800、900 W 對(duì)多糖提取效果的影響情況；固定其它因素及水平：液料比25∶1（mL/g），提取溫度50℃，超聲功率800 W，考察不同超聲時(shí)間5、10、15、20、25、30 min對(duì)多糖提取效果的影響情況。

1.2.5 香荔核多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

參考單因素試驗(yàn)的考察結(jié)果，設(shè)立多糖提取率為響應(yīng)值（Y），提取溫度（A）、液料比（B）及超聲功率（C）為自變量，截取任一因素中3個(gè)對(duì)多糖提取率具有顯著影響效果的水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken法對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)[25-27]，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.2.6 香荔核多糖抗氧化活性的體外測(cè)試

1.2.6.1 香荔核多糖對(duì)·OH（羥基自由基）清除效果的測(cè)定

分別向5支干凈試管中依次加入9.000 mmol/mL硫酸亞鐵溶液1.00 mL、9.000 mmol/mL水楊酸-乙醇溶液1.00 mL、蒸餾水1.00 mL、8.800 mmol/mL過(guò)氧化氫溶液1.00 mL、不同濃度的待測(cè)多糖溶液各1.00 mL。混合均勻，37℃恒溫反應(yīng)1 h，514 nm處測(cè)定體系吸光度Ax。固定其它條件及操作流程，以蒸餾水取代過(guò)氧化氫溶液，測(cè)定對(duì)照吸光度A1；以蒸餾水取代待測(cè)多糖溶液，測(cè)定空白吸光度A0，香荔核多糖對(duì)·OH的清除率按如下公式進(jìn)行計(jì)算[28]：

對(duì)·OH 的清除率 η/%=[A0-（Ax-A1）]/A0×100

1.2.6.2 香荔核多糖對(duì)O2-·（超氧陰離子自由基）清除效果的測(cè)定

分別向5支干凈試管中依次加入pH=8.2TriS-HCl緩沖溶液2.25 mL、10.00 mmol/L鄰苯三酚溶液30.00 μL、不同濃度待測(cè)多糖溶液0.50 mL，混合均勻，室溫反應(yīng)20 min，325 nm處4 min內(nèi)每30秒測(cè)定一次體系吸光度，計(jì)算有多糖存在時(shí)的鄰苯三酚自氧化速率Ax。固定其他條件及試驗(yàn)流程，以蒸餾水取代待測(cè)多糖溶液，計(jì)算無(wú)多糖存在時(shí)的鄰苯三酚自氧化速率A0，香荔核多糖對(duì)O2-·的清除率按如下公式進(jìn)行計(jì)算[29]：

對(duì) O2-·的清除率 η/%=（A0-Ax）/A0×100

1.2.6.3 香荔核多糖總還原力的測(cè)定

分別向5支干凈試管中依次加入不同濃度待測(cè)多糖溶液1.00 mL、pH=6.6磷酸緩沖溶液2.50 mL、1%鐵氰化鉀溶液2.50 mL，混合均勻，50℃恒溫反應(yīng)25 min。取出，冷卻至室溫，繼續(xù)加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，3 000 r/min恒速離心10 min。取上清液2.50 mL，依次加入蒸餾水2.50 mL、0.1%三氯化鐵溶液1.00 mL，混合均勻后室溫反應(yīng)10 min，700 nm處測(cè)定體系吸光度Ax。固定其他條件及試驗(yàn)流程，以蒸餾水取代鐵氰化鉀溶液，測(cè)定對(duì)照吸光度A1；以蒸餾水取代待測(cè)多糖溶液，測(cè)定空白吸光度A0，香荔核多糖的總還原力按如下公式進(jìn)行計(jì)算[30]：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 香荔核多糖提取率隨提取溫度變化的趨向

體系溫度可以明顯影響分子運(yùn)動(dòng)的劇烈程度。香荔核多糖提取率隨提取溫度變化的趨向見(jiàn)圖1。

圖1 香荔核多糖提取率隨提取溫度變化的趨向Fig.1 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on temperature

如圖1所示，溫度在較低范圍時(shí)，多糖分子運(yùn)動(dòng)能力隨體系溫度升高而加強(qiáng)，多糖提取率提高且增速顯著，當(dāng)體系溫度設(shè)定在60℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值10.84%。多糖分子作為一種有機(jī)分子對(duì)溫度變化較為敏感，在高溫下易失去生物活性以沉淀形式析出導(dǎo)致多糖提取率下降。因此提取溫度設(shè)定在60℃比較合適。

2.1.2 香荔核多糖提取率隨液料比變化的趨向

溶劑量較多時(shí)，體系擴(kuò)散壓較大，有利于多糖分子向外擴(kuò)散。香荔核多糖提取率隨液料比變化的趨向見(jiàn)圖2。

如圖2所示，初始階段，多糖提取率隨液料比增大而提高，當(dāng)液料比設(shè)定為25∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值10.45%。過(guò)度增大液料比使得溶劑用量增速快于多糖提取率增速，不僅造成溶劑浪費(fèi)，亦會(huì)導(dǎo)致樣品中其它雜質(zhì)成分溶出。綜合考慮提取效率及后續(xù)濃縮工作，本著節(jié)約的原則，液料比設(shè)定在25 ∶1（mL/g）比較合適。

圖2 香荔核多糖提取率隨液料比變化的趨向Fig.2 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on liquid-material ration

2.1.3 香荔核多糖提取率隨超聲功率變化的趨向

超聲波能夠提高提取效率主要在于其可以破碎細(xì)胞壁加快多糖分子的溶出。香荔核多糖提取率隨超聲功率變化的趨向見(jiàn)圖3。

圖3 香荔核多糖提取率隨超聲功率變化的趨向Fig.3 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on ultrasonic power

超聲時(shí)間一定時(shí)，如圖3所示，隨著超聲功率增強(qiáng)，細(xì)胞壁破碎效果愈佳，多糖分子充分溶出，提取率上升。當(dāng)超聲功率設(shè)定在700 W時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值10.64%。超聲功率進(jìn)一步增大，多糖分子受過(guò)強(qiáng)的機(jī)械作用及空化效應(yīng)影響其穩(wěn)定性下降，可能水解生成寡聚糖甚至單糖，提取率下降。綜合考慮試驗(yàn)后續(xù)處理及能源節(jié)約，超聲功率設(shè)定在700 W比較合適。

2.1.4 香荔核多糖提取率隨超聲時(shí)間變化的趨向

細(xì)胞壁破碎效果越好，多糖分子越容易溶出。香荔核多糖提取率隨超聲時(shí)間變化的趨向見(jiàn)圖4。

圖4 香荔核多糖提取率隨超聲時(shí)間變化的趨向Fig.4 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on ultrasonic time

當(dāng)超聲功率一定時(shí)，由圖4所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞壁被充分破碎，有利于多糖分子從樣品中溶出并向外擴(kuò)散，多糖提取率上升。當(dāng)超聲時(shí)間設(shè)定在20 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值10.27%。超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖分子運(yùn)動(dòng)加劇產(chǎn)生較多熱量，多糖的糖苷鍵吸收足夠熱量并在超聲波作用下發(fā)生斷裂轉(zhuǎn)化為寡糖導(dǎo)致提取率下降。因此超聲時(shí)間設(shè)定在20 min時(shí)比較合適。

2.2 香荔核多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析

在提取香荔核多糖的單因素試驗(yàn)考察中發(fā)現(xiàn)，多糖提取率隨超聲時(shí)間變化波動(dòng)比較平緩，說(shuō)明超聲時(shí)間的影響不顯著，為4個(gè)考察因素中的次要因素。因此，設(shè)立多糖提取率為響應(yīng)值（Y），以提取溫度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）三因素為自變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)，安排并嚴(yán)格實(shí)施17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的回歸試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 回歸方程的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件程序統(tǒng)計(jì)分析表2中展示的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得到多糖提取率（Y）對(duì)提取溫度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）的三元二次回歸方程：

對(duì)所建立的香荔核多糖提取工藝回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Analysis of varlance of regression model

該模型p＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)p=0.306 3＞0.05，不顯著，說(shuō)明除考察因素外，試驗(yàn)過(guò)程不受其它因素影響或影響可忽略，殘差主要由隨機(jī)誤差引起。決定系數(shù)R2=0.977 1、R2Adj=0.947 6，說(shuō)明該回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程匹配程度高，可行，因此可以利用該回歸模型分析及預(yù)測(cè)試驗(yàn)過(guò)程中多糖提取率隨因素、水平變化的波動(dòng)情況。

3個(gè)優(yōu)化設(shè)計(jì)因素中，提取溫度的二次項(xiàng)A2（p=0.000 4）、液料比 B（p=0.000 4）、超聲功率 C（p＜0.000 1）及其二次項(xiàng)C2（p=0.000 1）對(duì)香荔核多糖提取率的影響均為極顯著水平（p＜0.01），且三因素的主次順序?yàn)椋撼暪β剩疽毫媳龋咎崛囟取Ｍ瑫r(shí)，3個(gè)優(yōu)化設(shè)計(jì)因素之間的交互作用中，交互作用 AB（p=0.000 4）、BC（p=0.005 8）對(duì)多糖提取的影響極顯著，交互作用AC（p=0.076 5）的影響不顯著。

2.2.3 多糖提取率隨交互作用變化的趨向響應(yīng)面分析圖

依據(jù)該回歸模型的方差分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制出多糖提取率與三優(yōu)化設(shè)計(jì)因素之間交互作用的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 香荔核多糖提取率隨交互作用AB變化的趨向響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface of polysaccharides’extraction trend from semen litchi affect by interactive AB

圖6 香荔核多糖提取率隨交互作用AC變化的趨向響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface of polysaccharides’extraction trend from semen litchi affect by interactive AC

圖7 香荔核多糖提取率交互作用BC變化的趨向響應(yīng)面分析圖Fig.7 Response surface of polysaccharides’extraction trend from semen litchi affect by interactive BC

比較圖5、圖6、圖7可以發(fā)現(xiàn)，交互作用AB、BC的響應(yīng)曲面具有顯著的陡坡，而交互作用AC的響應(yīng)曲面相對(duì)平滑。相關(guān)因素對(duì)多糖提取效果影響的顯著性與響應(yīng)面的陡峭程度成正比，可知，交互作用AB、BC可以極為顯著地影響多糖的提取效果。等高線圖中，中心圖形橢圓率越高說(shuō)明該因素的影響效果越顯著。圖5、圖6、圖7中，交互作用AB、BC中心橢圓率明顯高于交互作用AC，說(shuō)明交互作用AB、BC對(duì)多糖提取率的影響顯著強(qiáng)于交互作用AC。

2.2.4 香荔核多糖最佳提取工藝參數(shù)的確定及試驗(yàn)驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析，確定最佳提取工藝條件：提取溫度57.48℃，液料比為 23.76∶1（mL/g），超聲功率 623.3 W，在該條件下進(jìn)行試驗(yàn)，香荔核多糖的提取率可達(dá)10.72%。檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型的準(zhǔn)確性，在方便操作的基礎(chǔ)上，調(diào)整工藝參數(shù)：提取溫度58℃，液料比為 24 ∶1（mL/g），超聲功率 620 W，超聲時(shí)間 20 min，嚴(yán)格執(zhí)行該條件，平行試驗(yàn)5次，實(shí)測(cè)多糖平均提取率為10.04%，接近預(yù)測(cè)值10.72%，說(shuō)明該回歸模型可行，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 香荔核多糖抗氧化活性的體外測(cè)試結(jié)果

2.3.1 香荔核多糖對(duì)·OH清除效果的測(cè)定

·OH是生命體中產(chǎn)生的最具氧化性能的自由基。多糖分子中含有的大量活性氫原子可湮滅·OH，從而消除·OH對(duì)內(nèi)臟器官的危害。香荔核多糖對(duì)·OH清除效果隨濃度變化的趨向見(jiàn)圖8。

由圖8可知，香荔核多糖對(duì)·OH具有較好的清除效果，且清除率增速隨多糖濃度的增加顯著加快，當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)可清除74.44%的·OH，但明顯弱于同等濃度水平VC對(duì)·OH的清除能力。

2.3.2 香荔核多糖對(duì)O2-·清除效果的測(cè)定

O2-·是生命體中最先產(chǎn)生的一種自由基，也是所有自由基的最初模式，反應(yīng)形式多樣。多糖分子中含有醛羰基，可以被氧化，也可以被還原。香荔核多糖對(duì)O2-·清除效果隨濃度變化的趨向見(jiàn)圖9。

由圖9可知，香荔核多糖對(duì)O2-·具有極高的反應(yīng)活性，能夠清除絕大部分O2-·，且清除率隨濃度增加迅速升高。當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)可清除86.52%的O2-·，清除效果趨近于同等濃度水平VC對(duì)O2-·的清除能力。

圖9 香荔核多糖對(duì)O2-·清除效果隨濃度變化的趨向Fig.9 The scavenging trend of polysaccharides from semen litchi on O2-·

2.3.3 香荔核多糖總還原力的測(cè)定

多糖分子中含有醛羰基，可以有效的還原氧化劑，因而具備一定的還原能力。香荔核多糖總還原力隨濃度變化的趨向見(jiàn)圖10。

圖10 香荔核多糖總還原力隨濃度變化的趨向Fig.10 The trend of polysaccharides’total reducing power from semen litchi

由圖10可知，隨著多糖濃度增加，醛羰基含量上升，多糖總還原力隨之提高。當(dāng)多糖濃度＞0.3 mg/mL時(shí)，總還原力隨濃度升高繼續(xù)增加但增速趨緩。當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，總還原力達(dá)到0.596。在所研究的濃度范圍內(nèi)，香荔核多糖的總還原力均明顯弱于同等濃度水平VC的總還原力。

3 結(jié)論

本課題采用超聲波輔助熱水浸提法提取香荔核中的多糖。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)該提取方法實(shí)施響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，取得了該工藝的回歸模型。通過(guò)對(duì)該模型進(jìn)行方差分析可知，該模型與實(shí)際提取過(guò)程具有極好的匹配度，可用于試驗(yàn)中分析及預(yù)測(cè)多糖提取率隨因素、水平變化的波動(dòng)情況。在所考察的因素水平范圍中，各因素對(duì)多糖提取率的影響顯著順序：超聲功率＞液料比＞提取溫度，其中提取溫度與超聲功率的交互作用、液料比與超聲功率的交互作用對(duì)多糖提取率亦有極顯著影響。在模型分析的基礎(chǔ)上結(jié)合實(shí)際操作，確定香荔核多糖最佳提取工藝參數(shù)：提取溫度58℃，液料比 24 ∶1（mL/g），超聲功率 620 W，超聲時(shí)間 20 min，此條件經(jīng)平行試驗(yàn)證實(shí)平均提取率10.04%與模型預(yù)測(cè)值10.72%相近，可行。多糖的抗氧化活性體外測(cè)試表明，多糖具有較強(qiáng)的清除自由基能力，當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH、O2-·的清除率可達(dá)74.44%、86.52%，總還原力為0.596，且其抗氧化活性與多糖濃度成正向線性關(guān)系。本課題的研究成果為荔枝核中有效物質(zhì)的提取、應(yīng)用及百色荔枝的綜合開(kāi)發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支持。