芒果果皮多糖酶法提取及其體外抗氧化活性

趙仕花，盧明順，巫楚軍，農貴珍，陳曉白，蔣德旗，2，*

（1.玉林師范學院生物與制藥學院，廣西玉林537000；2.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，廣西玉林537000）

芒果（Mangifera indica L.）屬于漆樹科植物，主要分布在我國廣西、海南、云南等地，其中芒果葉富含黃酮和酚酸類等，芒果果實富含糖類、有機酸類、類胡蘿卜素等活性成分[1-2]，具有多種藥理作用，如芒果苷抗氧化與調節糖脂代謝、止咳平喘等[3-5]。現有研究主要針對芒果葉部位的有效成分，而對芒果果實、樹皮等化學成分和藥理作用的研究尚少。果皮是芒果食用及加工過程中的廢棄物，研究發現芒果皮提取物可以改善高脂血癥模型大鼠血脂水平和肝功能，并具有一定的抵抗脂質過氧化作用[6]。為提高芒果資源綜合利用率及進一步了解芒果多糖的生物活性，本研究探討纖維素酶提取芒果果皮多糖的最佳條件，并研究其體外抗氧化活性，為芒果果皮多糖開發利用提供一定的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果：品種為桂七芒，市售，本研究取其干燥果皮作為材料；纖維素酶（食品級，5萬U/g）、維生素C、D-無水葡萄糖：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：日本TCI公司；其它試劑均為國產分析純。

5810R型高速離心機：德國eppendorf公司；Alpha-1506型紫外分光光度計：上海譜元儀器有限公司；SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器：常州華普達教學儀器有限公司；PHS-25型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SHB-III型循環水真空泵、2L-ARE旋轉蒸發器：上海皓莊儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芒果果皮多糖提取

多糖提取具體操作方法參照文獻[7]進行，主要包括粉碎、特定酶解條件下提取、高溫滅活、分離濃縮、乙醇沉淀、Sevage法脫蛋白、二次醇沉、真空冷凍干燥等系列步驟。

1.2.2 多糖含量測定

多糖測定采用苯酚-硫酸法，葡萄糖標準曲線方程為 y=8.498 6x-0.018 5，R2=0.990 3，式中 y為 490 nm條件下的吸光度值、x為葡萄糖質量濃度（mg/mL）。多糖得率/%=cnV/m×100。

式中：c為樣品稀釋液中多糖的濃度，mg/mL；n為稀釋倍數；V為樣品稀釋液體積mL；m為芒果果皮粉末質量，mg。

1.2.3 多糖提取單因素試驗

酶解時搖床轉速固定為180 r/min，分別考察pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、液料比[4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1、20 ∶1（mL/g）]、酶添加量（2、6、10、14、18 mg/mL）、酶解時間（40、80、120、160、200 min） 和酶解溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）對芒果果皮多糖得率的影響，其中各因素固定水平為pH 5.0、液料比 8∶1（mL/g）、酶添加量10 mg/mL、酶解時間80 min、酶解溫度45℃。

1.2.4 響應面試驗

響應面因素水平設計見表1，自變量包括酶解pH值、酶解時間、酶添加量、液料比4個因素，以多糖得率為響應值。數據分析采用Design Expert 8.06軟件。

表1 響應面因素設計及水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.5 芒果果皮多糖體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定

取不同質量濃度的樣品溶液2 mL和2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混勻，反應30 min后在517 nm處測定其吸光度A1，同法測定2.0 mL乙醇加樣液的吸光度A2，以及2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水的吸光度A0，以維生素C作為對照，樣品對DPPH自由基的清除率 Y/%=[1-（A1-A2）/A0]×100[7]。

1.2.5.2 ·OH清除能力測定

取不同質量濃度的樣品提取液2 mL，依次加入濃度均為5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2 mL，混勻，靜置10 min，再加入5 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，混勻，37℃水浴30 min后，波長510 nm處測定吸光度B1，用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度B2，以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度B0，以維生素C作為對照，樣品對·OH 的清除率 Y/%=[1-（B1-B2）/B0]×100[7-8]。

2 結果與分析

2.1 單因素對芒果果皮多糖得率的影響

纖維素酶添加量對多糖得率的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Influence of cellulase addition amount on the polysaccharide extraction rate

由圖1可知，當酶添加量增加到10 mg/mL時，多糖得率可達4.37%，進一步加大酶用量，多糖得率沒有顯著變化，說明在該底物濃度下，酶濃度已經趨于飽和，繼續增加纖維素酶用量，對多糖得率沒有顯著影響，選擇10 mg/mL作為酶的最佳添加量。

pH值對多糖得率的影響見圖2。

圖2 pH值對多糖得率的影響Fig.2 Influence of pH value on the polysaccharide extraction rate

由圖2可知，當pH值增加到5.0時，多糖得率達到最大值4.45%，pH=7.0時多糖得率反而降低，酶解最佳pH值選定為5.0。

液料比對多糖得率的影響見圖3。

由圖3可知，當液料比增加到 8∶1（mL/g）時，多糖得率達到4.31%，之后，隨著液料比增大，多糖得率反而減小，原因可能與過高液料比不利于多糖物質溶出有關，此外，水用量過大加重后續濃縮工作負擔，不利于工業化實際生產，故液料比優化為8∶1（mL/g）。

酶解溫度對多糖得率的影響見圖4。

圖3 液料比對多糖得率的影響Fig.3 Influence of the ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate

圖4 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.4 Influence of hydrolysis temperature on the polysaccharide extraction rate

由圖4可知，隨著溫度的升高，多糖得率先提高后降低，這是由于溫度過高導致酶活力減弱所致，選擇45℃為本研究最佳酶解溫度。

酶解時間對多糖得率的影響見圖5。

圖5 酶解時間對多糖得率的影響Fig.5 Influence of hydrolysis time on the polysaccharide extraction rate

由圖5可知，當酶解時間為80 min時，多糖得率4.34%接近120 min時的最大值4.37%，本研究選擇80 min為最佳酶解時間。

2.2 芒果果皮多糖纖維素酶提取的響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果與分析

試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 芒果果皮多糖提取的響應面試驗結果Table 2 Results of response surface design for Mangifera indica L.rind polysaccharides extraction

表3 芒果果皮多糖提取響應面試驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface design for Mangifera indica L.rind polysaccharides extraction

續表3 芒果果皮多糖提取響應面試驗結果的方差分析Continue table 3 Variance analysis of response surface design for Mangifera indica L.rind polysaccharides extraction

對表2中數據進行回歸擬合，獲得自變量（酶解pH值、酶解時間、酶添加量、液料比）與芒果果皮多糖得率（Y）的二次多項回歸方程：

Y=4.55-0.031A+0.83B+0.14C-0.17D+0.01AB-0.40AC+0.24AD+0.037BC-0.10BD-0.39CD-0.76A2-0.14B2-0.65C2-0.94D2。由表3可知，回歸方程模型P＜0.000 1，達到極顯著水平，失擬項P＞0.05不顯著（P=0.065 4），模型總決定系數R2=0.974 3，調整后R2Adj=0.948 6，以上參數均說明該模型與試驗數據擬合程度好，試驗誤差小，可用于不同變量條件下的響應值預測。

由表3F值可知，芒果果皮多糖纖維素酶法提取影響因素的主次順序為：酶解時間（B）＞液料比（D）＞酶添加量（C）＞酶解pH值（A），其中A影響不顯著，其它三因素均達到顯著水平。因素間交互作用對芒果果皮多糖得率的影響如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface graphs showing the interactions of various factors on polysaccharide yield

由圖6（b、c、f）和表3方差分析結果可知，AC、AD、CD交互作用顯著影響芒果果皮多糖酶法提取的得率，其中AC、CD達到非常顯著水平，AD達到顯著水平，其它兩因素間交互作用對多糖得率的影響均不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 最佳提取條件預測及驗證

對回歸模型方程求解，獲得芒果果皮多糖纖維素酶提取的最佳條件為酶解pH4.9，酶解時間100.0 min，酶添加量 10.46 mg/mL，液料比 7.6 ∶1（mL/g），此條件下多糖得率為5.28%。考慮實際操作方便，將上述最佳提取參數修改為酶解pH值5.0，酶解時間100.0 min，酶添加量 10.5 mg/mL，液料比 7.6 ∶1（mL/g），根據工藝條件進行3組平行試驗，所得多糖得率平均值為（5.17±0.64）%，與回歸方程理論多糖得率5.28%的相對誤差為2.08%，提示本響應面法得到的回歸模型有效、可靠，得到的纖維素酶提取芒果果皮多糖工藝條件具有實際應用價值。

2.3 芒果果皮多糖體外抗氧化活性

2.3.1 芒果果皮多糖對DPPH自由基清除作用

芒果果皮多糖對DPPH自由基的清除作用見圖7。

圖7 芒果果皮多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of polysaccharide from Mangifera indica L.rind on DPPH radical

由圖7可知，當芒果果皮多糖濃度在0.2 mg/mL～10 mg/mL時，對DPPH自由基清除率不斷增大，當質量濃度為10 mg/mL時，芒果果皮多糖對DPPH自由基清除率為90.14%，而維生素C對DPPH自由基清除率可達95.13%，芒果果皮多糖清除DPPH自由基的半數抑制濃度IC50為1.385 mg/mL，維生素C的IC50為0.716 mg/mL，兩者比較，芒果果皮多糖清除能力弱于維生素C。以上結果提示芒果果皮多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。

2.3.2 芒果果皮多糖對·OH清除作用

芒果果皮多糖對·OH的清除作用見圖8。

圖8 芒果果皮多糖對·OH的清除作用Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Mangifera indica L.rind on hydroxyl radical

由圖8可知，當芒果果皮多糖濃度在0.2 mg/mL～10 mg/mL時，對·OH清除率穩步提升，而維生素C在濃度6 mg/mL時對·OH清除率就已達到最大值95.08%，之后趨于穩定。當質量濃度為10 mg/mL時，芒果果皮多糖對·OH清除率為89.24%，維生素C對·OH清除率可達94.69%，芒果果皮多糖清除·OH的IC50為3.612 mg/mL，維生素C的IC50為0.587 mg/mL，兩者比較，維生素C清除能力強于芒果果皮多糖。以上結果說明芒果果皮多糖具有較好的·OH清除作用。

3 結論討論

天然植物多糖越來越受到學者的重視，主要因為其具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、提供免疫功能等，還具有毒副作用低等特點。天然產物多糖來自于植物細胞膜和微生物細胞壁的天然高分子化合物，可采用有機溶劑、酶解等方法提取，其中酶解提取操作簡單、條件較溫和，在多糖結構研究以及活性保持方面具有一定的優勢[9]。植物多糖具有抗腫瘤、抗病毒、防衰老、降血糖等生物活性，可作為藥物和保健品的有效成分，藥食兩用植物多糖系列產品的市場前景將非常廣闊[10-11]。

芒果果皮約占整個鮮果的15%左右，果皮作為加工副產物，在企業生產中都作為廢棄物丟棄，對環境造成污染還浪費資源。芒果果皮中富含多糖、膳食纖維、苷類、揮發油等功效成分[12-14]，具有抗氧化、抑菌、調節脂代謝等作用[15-16]。研究表明，采用熱水浸提、乙醇沉淀法提取芒果不同部位多糖，其中果實多糖含量達到4.6%[2]，葉中多糖含量為1.5%[17]。林燕如等還使用超聲波輔助乙醇沉淀法提取芒果葉中多糖，提取量為1.0%[18]，對芒果有效成分多糖的研發將有助于提升其附加值。

本研究在單因素試驗基礎上，通過響應面設計優化了芒果果皮多糖纖維素酶提取的工藝。結果發現，纖維素酶酶解時間對芒果果皮多糖得率影響最顯著，其次是液料比、酶添加量，而酶解pH值對其多糖提取影響最小；芒果果皮多糖最佳酶解提取條件為酶解pH5.0，酶解時間 100.0 min，酶添加量 10.5 mg/mL，液料比7.6∶1（mL/g）、酶解溫度45℃，在此條件下芒果果皮多糖的得率為5.17%，與回歸模型方程預測值5.28%相比，相對誤差小于5%。張莉等采用超聲波輔助乙醇沉淀法提取芒果皮渣中多糖，結果表明在提取溫度80℃、超聲功率160 W、提取時間90 min、料液比1∶2（g/mL）、提取次數2次的條件下，芒果皮渣多糖得率為0.81%[19]，此外，王維民等研究表明芒果皮中粗多糖得率可達3.5%[20]，均低于本研究中酶法提取的多糖得率。

通過體外抗氧化活性試驗，芒果果皮多糖對DPPH自由基、·OH均具有較強的清除能力，在試驗質量濃度下其對兩種自由基的清除能力均呈現一定的正相關關系，與張莉等研究結果一致[19]。芒果果皮多糖清除DPPH自由基的IC50為1.385 mg/mL，清除·OH的IC50為3.612 mg/mL。但與維生素C比較，芒果果皮多糖清除兩種自由基的能力較弱。以上研究結果可為芒果果皮多糖的研究開發提供一定的前期理論基礎。