復合龍眼果醋的醋酸發酵工藝優化及其風味成分分析

（廣東石油化工學院石油化工清潔生產工程技術開發中心，廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發中心，廣東茂名525000）

龍眼，又稱桂圓，為無患子科龍眼屬植物。龍眼樹為常綠喬木，食用部分是假種皮，乳白或淡白色，肉質脆，清甜[1]。其果肉含有多種營養物質，有補血安神、健腦益智、補養心脾的功效，是健脾長智的傳統食物，對失眠、心悸、神經衰弱、記憶力減退、貧血及抗衰老等有益[2-3]。

我國龍眼產業規模化、產品系列化正在形成，傳統產品形式為鮮果、龍眼干及龍眼肉干[4]，深加工產品如龍眼果汁[5]、龍眼果酒[6]和龍眼果醋[7]等也有研究開發。龍眼果酒和龍眼果醋屬于發酵食品，近年來龍眼果酒的研究更為常見，例如，龍眼酒菌種篩選[8]、工藝優化[9-10]及風味分析[11]均有報道。龍眼果醋是在龍眼果酒的基礎上進行醋酸發酵后制得，目前對龍眼果醋發酵工藝的研究相對較少，且缺乏對龍眼果醋風味分析的研究[12-14]。

針對目前龍眼果醋工藝研究較少，風味分析缺乏的現狀，本研究以龍眼和檸檬復合果汁為主原料，接種活性干酵母經酒精發酵得到基酒，以基酒為基礎，單因素及正交試驗優化了復合龍眼果醋的醋酸發酵工藝，對優化工藝釀造所得復合龍眼果醋進行質量評價，并利用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析了其風味成分，為更符合當代人們健康理念的龍眼果醋的成功開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與菌株

“儲良”品種新鮮龍眼：產自廣東省茂名市高州；檸檬：市售；干酵母：湖北安琪酵母有限公司；滬釀1.01醋酸菌：廣東石油化工學院食品教研室保藏。

1.1.2 試劑與儀器設備

普通級別白砂糖：市售；氫氧化鈉、溴鉀酚紫、鹽酸、偏重亞硫酸鉀、無水乙醇、酚酞、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）：廣州化學試劑廠；蛋白胨、葡萄糖、膽鹽、果膠酶（500 U/mg）、乳糖、瓊脂：生工生物工程（上海）股份有限公司。

HB-K800型榨汁機：廣東半球電器有限公司；DHZ-DA型臥式恒溫搖床：常州杰博森儀器有限公司；LX-B35L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：濟南博華儀器有限公司；J-HH-6A型精密數顯恒溫水浴鍋：冠森生物科技（上海）有限公司；SPX-250數顯生化培養箱：上海昕儀儀器儀表有限公司；V5000型可見光分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS-3C雷磁pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；WZ系列手持折光糖度計：浙江托普云農科技股份有限公司；RHWN-25OeATC手持折光酒度計：漳州市新奧光電儀器有限公司；2010QP-Plus型氣質聯用儀：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 復合龍眼果醋的工藝及操作要點

復合龍眼果醋的工藝主要包括鮮龍眼果汁制備、鮮檸檬果汁制備、龍眼檸檬復合果汁調配、酒精發酵、醋酸發酵及滅菌過濾等步驟等[15]，具體操作步驟見圖1。

圖1 復合龍眼果醋的工藝流程Fig.1 Technological process of compound longanfruit vinegar

龍眼汁的制備：鮮龍眼去皮去核取果肉后稱重，打漿榨汁后于龍眼汁中按龍眼果肉的重量，添加15 g/100 kg的偏重亞硫酸鉀；然后在龍眼汁中添加終濃度為0.2 g/L的果膠酶，45℃放置，酶解2小時后過濾[10]。

龍眼檸檬復合果汁調配：新鮮檸檬去皮去核取果肉打漿榨汁過濾后，不斷攪拌下添加于上述處理的龍眼汁中，不間斷測其pH值變化，當pH值達到3.5時，完成復合龍眼檸檬汁調配。

酒精發酵得基酒：上述龍眼檸檬復合果汁加白砂糖調配初始糖度為22%，活性干酵母按產品說明書活化后按接種量15%接入，于22℃靜置發酵7天后得到復合龍眼果醋釀造基酒[6-11]。

醋酸發酵：將活化后的醋酸菌加入復合龍眼果酒中進行醋酸發酵，置于恒溫搖床上進行振蕩發酵，7 d左右醋酸菌將乙醇轉化為乙酸，乙酸不再變化時，發酵完成，復合龍眼果醋生成[12-14]。本研究中通過單因素及正交試驗優化了復合龍眼果醋的醋酸發酵階段的工藝。

滅菌過濾：采用巴氏消毒法（70℃，5 min）對復合龍眼果醋進行滅菌，澄清后過濾。

1.2.2 復合龍眼果醋醋酸發酵階段的單因素試驗

以總酸含量為指標，分別考察發酵溫度、基酒初始酒度、醋酸菌接種量及搖床轉速等因素對醋酸發酵的影響，試驗于250 mL的錐形瓶中進行，裝載量均為50 mL，每個試驗處理設置3個重復，其具體條件設置如下：

發酵溫度：基酒初始酒度10%，醋酸菌接種量10%，搖床轉速為180 r/min，發酵溫度設定為27、30、33、36、39℃，發酵7天后測定總酸含量，總酸（以乙酸計）采用酸堿滴定法測定。

基酒的初始酒度：發酵溫度33℃，醋酸菌接種量10%，搖床轉速為180 r/min，基酒的初始酒度設定為6%、8%、10%、12%、14%（體積比），發酵7天后測定總酸含量。

醋酸菌接種量：發酵溫度33℃，基酒初始酒度10%，搖床轉速為180 r/min，醋酸菌接種量設定為6%、8%、10%、12%和14%，發酵7天后測定總酸含量。

搖床轉速：發酵溫度33℃，基酒初始酒度10%，醋酸菌接種量10%，搖床轉速設定為120、140、160、180 r/min和200 r/min，發酵7天后測定總酸含量。

1.2.3 正交試驗法優化復合龍眼果醋的醋酸發酵工藝

由以上的單因素試驗結果，選取發酵溫度（30、33、36℃）、基酒初始酒度（8%、10%、12%）、醋酸菌接種量（8%、10%、12%），進行三因素三水平的正交試驗優化復合龍眼果醋的醋酸發酵工藝，試驗于250 mL的錐形瓶中進行，裝載量均為50 mL，試驗重復3次，發酵7天后測定總酸含量，取其平均值作為優化指標。

1.2.4 復合龍眼果醋的質量指標評價

根據GB2719-2003《食醋衛生標準》，對復合龍眼果醋的感官、理化及微生物指標進行評價[16]。

1.2.5 GC-MS分析復合龍眼果醋的風味成分

萃取條件[17]：準確量取5 mL果醋，移入10 mL鉗口樣品瓶中，加入2.00 g NaCl，聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器上加熱至60℃，平衡30 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭頂空吸附 40 min，插入GC進樣口解析5 min，進行GC-MS分析。

GC 條件[11]：DB-WAX 色譜柱（30 m × 0.25 μm ×0.25 mm），進樣口溫度為240℃，載氣為He，流速為1.83 mL/min，檢測器溫度為35℃。柱溫采用程序升溫方式：35℃保持3 min，以10℃/min升至115℃，保持3 min，然后以5℃/min升至235℃，保持10 min。

MS條件[11]：EI電子轟擊源，離子源溫度200℃，電離電壓70 eV，接口溫度250℃，掃描范圍45 m/z～450 m/z。

定性定量分析[18-19]：檢索質譜自帶的NIST2.0和Wiley譜庫，再結合有關文獻進行人工譜圖解析，確認各種香氣成分。采用峰面積歸一化法計算出各組分的相對含量。

1.2.6 數據處理

應用SPSS12.0統計軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 復合龍眼果醋醋酸發酵單因素試驗結果

各因素對復合龍眼果醋醋酸發酵階段的影響如圖2所示。

溫度對復合龍眼果醋的醋酸發酵影響顯著，30℃～36℃內總酸含量較高（圖2A），因此，選取 30、33、36℃這3個溫度水平進行醋酸發酵正交試驗。從圖2B可以看出在8%～14%的基酒初始酒度范圍內，復合龍眼果醋的總酸差異顯著，在8%～12%間復合龍眼果醋的總酸含量較高，因此，選取8%、10%、12%這3個基酒初始酒度水平進行醋酸發酵正交試驗。圖2C中可以看出，在8%～14%內的醋酸菌接種量對復合龍眼果醋的醋酸發酵影響顯著，8%～12%的接種量范圍內復合龍眼果醋的總酸含量較高，因而，選取8%、10%、12%這3個醋酸菌接種量水平進行醋酸發酵正交試驗。圖2D表明，在不同的轉速條件下，總酸含量的變化不顯著，因此，不選取發酵轉速作為正交試驗的因素。

圖2 各因素對復合龍眼果醋醋酸發酵階段的影響Fig.2 Effect of single factor on acetic acid fermentation for compound longan fruit vinegar

2.2 正交試驗法優化復合龍眼果醋的醋酸發酵工藝的結果分析

正交試驗法優化復合龍眼果醋的醋酸發酵工藝的結果如表1所示。

表1 復合龍眼果醋醋酸發酵L9（33）正交試驗結果Table 1 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation for compound longanfruit vinegar

續表1 復合龍眼果醋醋酸發酵L9（33）正交試驗結果Continue table 1 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation for compound longanfruit vinegar

由表1可知，發酵溫度、基酒初始酒度和醋酸菌接種量這3個因素所對應的極差（R）大小順序為：B＞C＞A，從而得知影響復合龍眼果醋醋酸發酵的主次因素依次為基酒初始酒度、醋酸菌接種量、發酵溫度。

而k1、k2、k3分別為各因素各水平所對應的總酸含量的平均值，由表1可知，在 A 因素中，k2＞k1＞k3；在 B因素中，k2＞k3＞k1；在 C 因素中，k3＞k2＞k1。因此，各因素水平對結果影響的強弱順序是：A2＞A1＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，由此可得出復合龍眼果醋的釀造工藝的最優方案為A2B2C3。

綜合分析，最終確定復合龍眼果醋的釀造工藝的最佳組合方案是A2B2C3，即發酵溫度為33℃、基酒的初始酒度10%、醋酸菌接種量12%。在此條件，3次重復驗證試驗結果為，復合龍眼果醋的總酸含量為（6.80±0.06）g/100 mL。

2.3 復合龍眼果醋的質量評價

2.3.1 復合龍眼果醋的感官指標

復合龍眼果醋感官指標的評價結果見表2。

表2 復合龍眼果醋的感官評價表Table 2 Sensory evaluation of compound longan fruit vinegar

結果表明，以龍眼和檸檬為原料采用最佳醋酸發酵工藝釀制而成的復合龍眼果醋產品色澤金黃亮麗，酸味柔和，口感上佳，體態透明清澈無沉淀，具有特有的果香和醋香。該復合龍眼果醋感官指標符合GB 18187-2000《釀造食醋》。

2.3.2 龍眼檸檬汁、復合龍眼果酒、復合龍眼果醋理化成分指標比較

對復合龍眼果醋中總酸含量、總糖、還原糖進行測定，得出復合龍眼果醋的理化指標，結果見表3。

表3 龍眼檸檬汁、復合龍眼果酒、復合龍眼果醋的理化成分指標Table 3 Physicochemical indexes of longan-lemon juice，fruit wine and compound fruit vinegar

通過這3種物質的對比，復合龍眼果醋的總酸符合國家標準，相對于其他的兩樣物質，果醋的總酸含量是最高的，總糖與還原糖的含量相較于復合龍眼果酒也略高，因此，復合龍眼果醋的營養價值更高，更符合人們健康理念。

2.3.3 復合龍眼果醋的微生物指標

復合龍眼果醋微生物指標的評價結果見表4，表明復合龍眼果醋微生物指標均符合GB2719-2003。

表4 復合龍眼果醋的微生物指標Table 4 Microbial indicators of compound longan fruit vinegar

2.4 復合龍眼果醋風味成分的GC-MS結果分析

復合龍眼果醋中各組分質譜經計算機譜庫檢索及結合文獻資料分析，鑒定出21種風味物質，按照出峰時間順序列出，見表5。

表5 復合龍眼果醋風味物質GC-MS分析結果Table 5 GC-MS analysis results of flavor substances of compound longan vinegar

經統計，復合龍眼果醋的風味成分由醇類物質（8種）、烴類物質（4種）、酯類物質（4種）、酸類物質（3種）及醛酮類物質（2種）組成。其中醇類物質的相對含量最高，為72.82%；其余依次為，烴類物質9.08%，酯類物質8.56%，醛酮類物質6.81%，酸類物質2.71%。

復合龍眼果醋的風味物質中，相對含量較多的均為醇類，其相對含量及呈香分析如下：4-萜烯醇（18.35%）呈胡椒香味，alpha-松油醇（15.38%）呈熏衣草香味，3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇（13.42%）呈沉香味，（-）-4-萜品醇（9.2%）呈丁香味及香茅醇（8.27%）呈玫瑰香味等。

4種酯類物質相對含量均大于1%，其中：（Z）-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（橙花乙酸酯）相對含量最高（4.26%），呈橙花和玫瑰香氣及蜂蜜和覆盆子甜香味；其次為反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（乙酸香葉酯），相對含量1.91%，有玫瑰和熏衣草香氣；甲酸異戊酯相對含量1.31%，有特殊香味；乙酸苯乙酯（1.08%）呈玫瑰花香，帶蜂蜜樣香氣，類似蘋果樣的果香，并帶有可可和威士忌樣的香韻。

上述醇類物質和酯類物質是復合龍眼果醋風味的主要成分，是醋體芬芳飄香的保證[20]；另外其他的烴類、醛酮類、酸類物質也是復合龍眼果醋風味的重要組成部分，使得復合龍眼果醋酸味爽快、柔和，是果醋香氣不可缺少的重要物質。上述多種香氣成分比例協調適宜，造就了復合龍眼果醋飽滿的香氣和獨特的風味。

3 結論

復合龍眼果醋的最佳醋酸發酵工藝條件為發酵溫度33℃，基酒初始酒度10%，醋酸菌接種量12%，該工藝發酵所得復合龍眼果醋總酸可達6.80 g/100 mL。所制得復合龍眼果醋的感官、理化和微生物指標均符合國家標準，具有獨特風味。復合龍眼果醋的主要風味物質為醇類（4-萜烯醇、alpha-松油醇、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、（-）-4-萜品醇及香茅醇）、酯類（橙花乙酸酯、乙酸香葉酯、甲酸異戊酯及乙酸苯乙酯）等。相對于龍眼果實的風味成分烯烴類[21]，龍眼果酒的主要風味物質醇類（2，3-丁二醇、苯乙醇）及酯類（乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯及 1，4-丁內酯）[11]，復合龍眼果醋的主要風味物質有顯著差異，表現出其獨特風味。