電吸附分子印跡-固相微萃取聯用技術檢測復雜樣品痕量孔雀石綠殘留

陶涌 張玉霞 劉宇

孔雀石綠（malachite green，MG），又名堿性綠，是一種帶有金屬光澤的三苯甲烷類工業染料，常用來預防和治療魚類外部真菌和寄生蟲感染，曾廣泛應用于水產養殖業中。由于孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用，美國早在1993年已將孔雀石綠列為優先研究的致癌性化學物質，我國在農業行業標準《NY5071- 2002無公害食品魚藥使用準則》中也將孔雀石綠列為禁用藥物。然而，由于沒有低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產養殖中的使用屢禁不止。目前國內外對孔雀石綠的檢測多采用高效液相色譜、高效液相色譜-質譜聯用等方法，這些方法檢測過程繁瑣，對檢測儀器和檢測人員要求較高，且需要對樣品進行排除干擾和分離富集等復雜的前處理工作，不利于現場應用。孔雀石綠殘留對自然系統和人類健康的潛在危險越來越受到人們的重視，對其進行有效跟蹤、監測非常必要。因此，建立簡便、快速的分析方法對孔雀石綠殘留具有重要的意義。

本文結合分子印跡技術（Molecularly imprinted polymer，MIP）和固相微萃取技術（Solid- phase Microextraction，SPME）的優點，在MIP- SPME中引入電場作為新的作用力，發展了電吸附-分子印跡固相微萃取（EE- MIP- SPME）樣品前處理聯用技術。設計聯用萃取技術裝置，以自制的孔雀石綠（malachite green，MG）MIP- SPME涂層研究EE- MIP- SPME技術的萃取條件和萃取性能，建立MIPMG- SPME/HPLC聯用分析方法，實現復雜生物、環境樣品中孔雀石綠殘留的痕量分析。

孔雀石綠（MG，分析純），隱性孔雀石綠（LMG，分析純）購于國藥基團化學試劑有限公司。色譜純乙腈和甲醇購自美國Sigam公司。商品化的固相微萃取纖維（100 μm，PDMS涂層）購自美國Supelco公司。

MIPPy- MWCNTs/Pt纖維制備及EE- MIPSPME實驗在恒電位儀上完成。首先將拋光打磨后的Pt絲和不銹鋼絲，插入多壁羧基碳納米管（MWCNTs- COOH）的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）分散液中，Pt絲為正極，不銹鋼絲為負極，施加35 V電壓，Pt絲在溶液中停留大約5S后拔出。重復上述操作，以增加碳納米管在Pt絲上的聚合厚度，最終將Pt絲放入紅外干燥箱，干燥得到MWCNTs/Pt纖維。將制備好的纖維作為正極，不銹鋼絲作為負極，飽和甘汞電極做參比電極，在吡咯-孔雀石綠（PPyMG，0.05 mol/L）混合溶液中進行電聚合反應。在0.95 V的電壓下，聚合反應40min。在碳納米管表面形成以孔雀石綠為模板分子的分子印跡聚吡咯纖維（MIPPy- MWCNTs/Pt）。

將MIPPy- MWCNTs/Pt纖維為工作電極、不銹鋼絲為對電極、飽和甘汞電極為參比電極。于20mL小瓶中加入15mL不同濃度的MG溶液，在工作電極施加一定電壓，攪拌下萃取。萃取完成后，纖維用400 μL的2%乙酸的甲醇-水溶液（v/v=8：2）解吸，取20 μL解吸液進行液相色譜分析。

色譜條件：在室溫條件下進行，Zorbax XDB- C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm×5μm），流動相為醋酸/醋酸銨（50 mmol /L，pH為4.5）：乙腈=40：60 （V/V），流速1.0 mL/min，紫外檢測波長608 nm，進樣量為20 μL。

以自制孔雀石綠MIPPy- MWCNTs/Pt纖維研究了EE- MIP- SPME方法的萃取條件，如聚合物配方、施加電壓、萃取時間、解吸溶劑和時間、萃取溶劑、鹽濃度等。在電場作用下，吸附劑與吸附質之間的各種作用力得到增強，使得吸附劑的吸附能力增強。通過在SPME纖維上施加電壓改善固定相的吸附特性，實現對目標物質的增強吸附。因此，施加電壓的大小是影響萃取過程的關鍵因素。實驗分別比較了在EE- MIP- SPME、MIP- SPME和SPME不同模式下對不同濃度MG的水溶液的萃取效率。結果如圖1所示：EE- MIP- SPME、MIP- SPME的萃取量隨著樣品濃度的增加而增加，EE- MIP- SPME對MG具有更高的萃取能力，特別是在低濃度范圍內具有更明顯的促進作用。采用萃取時間為60 min，樣品溶液1μmol/L，考察了施加電壓對孔雀石綠MIP涂層萃取性能的影響。電壓在0～0.8V時，隨著電壓的增加，孔雀石綠的萃取量逐漸增大；當電壓超過0.8V以后，MG萃取量迅速降低，結果如圖2所示。

為了驗證所制備的孔雀石綠M IPPyMWCNTs/Pt萃取纖維的選擇性吸附效果，實驗選取孔雀石綠的結構類似物結晶紫（CV）和非結構類似物蘇丹紅II（Sudan II）兩種對照物，同時用MIPPy- MWCNTs/Pt與NIPPy- MWCNTs/ Pt（非分子印跡吡咯聚合物）作為固相微萃取纖維，在最優萃取條件下，進行EE- MIP- SPME萃取實驗。如圖3所示，與 NIP 萃取纖維相比，MIP萃取纖維對MG及其結構類似物CV具有更高的萃取效率，這表明MIP萃取纖維對模板分子及其結構類似物具有很好的選擇，而對非目標分子的識別較低。目標物質在 MIP 和NIP 萃取纖維上吸附能力的不同，可能是由于他們在孔徑、形狀及與分析物間功能基團之間的不同造成。

本實驗方法在最優萃取條件下，通過EEMIP- SPME聯用液相色譜（HPLC），對MG，CV混合水溶液的檢出限和線性范圍進行了考察。實驗結果顯示：在不同濃度水平上隨著目標物濃度增加，EE- MIPPy- SPME對兩種物質的吸附效率，在1- 500 μg/L范圍內，均呈現較好的線性關系，相關系數r分別0.9996和0.9958，檢出限為：MG 1.55 μg/L，CV 1.47 μg/L。

為了證實所建立的實驗方法具有潛在應用價值，我們將該方法用于加標魚池水和魚肉樣品中孔雀石綠殘留的分析，圖4顯示的分別是自制MIP萃取纖維在SPME和EE- MIP- SPME模式下對加標魚池水樣萃取后得到色譜圖。可以看出：采用MIP纖維SPME萃取，目標物峰高要比NIP纖維的高（圖4c，4d）。圖4e是在MIP纖維上施加直流電壓后萃取得到的色譜圖，得到的峰面積進一步增大。兩種實際樣品的加標回收率分別為87.7%- 108.7%和85.7%- 103.2%，相對標準偏差（RSD）為1.2% - 9.6%和4.6% -8.3%。實際樣品中目標分子的高回收率和低干擾性，表明本實驗建立的EE- MIP- SPME方法具有較高的選擇性，以孔雀石綠為模板，自制的MIPPy- MWCNTs/Pt萃取纖維具有良好的吸附性能。歐盟法律規定動物源食品中孔雀石綠的殘留量不得超過 2 μg/kg，因此本研究建立的方法能夠適用于監測復雜食品樣基質中痕量孔雀石綠殘留的含量。

1： MG；2： CV；a：魚池水樣品直接進樣；b：經商品化SPME萃取；c：經NIP纖維SPME萃取；d：經MIP纖維-SPME萃取；e：經EE-MIP-SPME萃取的加標樣品

項目基金：湖南省食品藥品監督管理局食品藥品安全科技項目（湘食藥科R201720）。