反相高效液相色譜法檢驗飲料中人工合成色素

張琦惠 梁偉 劉庚

目的：對飲料中7種人工合成色素（檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、赤蘚紅）進行高效液相色譜法（HPLC）分析。方法 用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，將樣品制成水溶液，經Mono Tower C18（3μm×100mm）色譜柱分離后，以甲醇：乙醇銨溶液（0.02mol/L）進行梯度洗脫，流速為1.00ml/min，在檢測波長為254nm條件下進行檢測，根據保留時間定性和與峰面積比較進行定量。結果：7種人工合成色素在1.00-20.00mg/L質量濃度范圍內的線性關系較為良好（r>0.999），回收率為95%- 101%，相對標準差（RSD）0.1%- 0.4%。結論：高效液相色譜法操作簡便，結果準確可靠，重復性好，可廣泛應用于飲料人工合成色素的檢測。

食品著色劑分為兩類：人工合成色素和天然色素，兩者相比，因人工合成色素的著色效果更佳，且成本較低，而被廣泛應用于食品生產中。人工合成色素的主要原料包括有苯、甲苯、萘和苯胺等，經有機反應（磺化、硝化、鹵化和偶氮化等）后制成色素，長期食用后會對人體健康造成嚴重的損害。GB 2760- 2011《食品添加劑使用衛生標準》中對食品添加劑的使用原則、允許使用的品種、使用范圍和最大使用量或殘留量進行了規定。目前，我國允許使用的人工合成色素包括有檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、赤蘚紅和酸性紅等。

目前，人工合成色素的檢測方式主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和毛細管電泳法等。此次研究根據GB5009.35- 2016《食品中合成色劑的測定》中的實驗原理，利用高效液相色譜法對飲料中的人工合成色素（檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、赤蘚紅）進行檢測，為相關檢測單位提供一定的參考依據。

材料和方法

儀器。Agilent 1260 高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器。

試劑。試劑與標準溶液：檸檬酸溶液（檸檬酸20g，加水至100ml，充分溶解）、甲醇-甲酸（6：4）溶液（甲醇60ml、甲酸40ml，）、無水乙醇-氨水-水（7：2：1）（無水乙醇70ml、氨水溶液20ml、水10ml）、乙酸銨溶液（乙酸銨1.54g，加水至1000ml）、PH=4與PH=6的水（水加檸檬酸溶液）。

人工合成色素標準溶液：檸檬黃1.00ml（國家標準物質中心1.00mg/ml）、新紅1.00ml（北京海岸鴻蒙標準物質技術有限公司1.00mg/ml）、日落黃2.00ml（中國計量學研究院度0.50mg/ml）、莧菜紅1.00ml（國家標準物質中心1.00mg/ml）、胭脂紅2.00ml（中國計量學研究院0.50mg/ml）、亮藍2.00ml（中國計量學研究院0.50mg/ml）、赤蘚紅2.00ml（國家標準物質中心0.50mg/ml）。

樣品處理。稱取20g樣品，置于100ml燒杯中，碳酸飲料直接進行10分鐘的超聲脫氣與在60℃水浴上脫氣之后進行比較，發現結果沒有太大出入，加入檸檬酸溶液調節pH值分別到2，4，6，然后加熱至60℃，將1g聚酰胺粉加少量水調成粥狀，倒入試樣溶液中，攪拌片刻，用G3垂融漏斗抽濾，經60℃PH=4的水洗滌5次后，用甲醇-甲酸混合溶液洗滌5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液洗滌5次（每次5ml），收集解析液，加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解定容至10ml，經濾膜0.45 mμ過濾后，進行HPLC檢測。發現在此次實驗中pH值在2或4或6時，所測的結果變化不大，故在此次實驗用檸檬酸溶液調節pH時，對分析的結果影響不大。

液相色譜分析條件。色譜柱：Mono Tower C18（3μm×100mm）代替Agilent5（T）C18 4.6*250mm 5μm發現粒徑的減少在檢測波長：254nm、柱溫：35℃、流速1.00ml/min、進樣量5 lμ、檢測器：二極管陣列檢測器；時對于合成色素有了更好的分離效果及分析時間大范圍的縮短；流動相：甲醇：乙酸銨溶液（0.02mol/ l）；梯度如表1所示。

結果

方法的線性范圍和檢出限。將以上7種人工合成色素標準溶液在設定的色譜條件下檢測，結果顯示，在1.00- 20.0mg/L質量濃度范圍內7種人工合成色素具有良好的線性關系，各色素的出峰時間、平均峰面積、檢出限和RSD如表2所示。

回收率實驗。同時取18份不含人工合成色素的樣品，各10g，分成2組，分別添加一定量的檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍和赤蘚紅混合標準溶液，加標回收和精密度試驗按1.5/1.6進行。結果顯示人工合成色素的回收率為95% - 101%，相對標準差（RSD）為0.1%- 0.3%。

討論

此次試驗基于GB5009.35- 2016《食品中合成著色劑的測定》開展試驗，實驗過程中采用甲醇和0.02mol/L乙酸銨為流動相進行梯度洗脫，以達到人工合成色素分離的效果。同時，將檢測波長設定為254nm、采用色譜柱 Mono Tower C18（3μm×100mm）時與其他檢測方法相比，HPLC具備操作簡便、成本較低和回收率較高等優點，適用于飲料中人工合成色素的檢測。同時如有陽性樣品在無質譜的情況下進行光譜200nm- 800nm掃描，與對照光譜圖進行比較、確定。