哮喘模型小鼠肺組織 TGF-β1、MMP-9、TIMP-1與氣道重塑相關(guān)性研究

王忠敏 湯衛(wèi)紅 王惠庭 管敏昌

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性為特征的慢性氣道非特異性炎癥性疾病[1]。氣道炎癥反復(fù)發(fā)生導(dǎo)致基底膜、平滑肌增厚、杯狀細(xì)胞和纖維組織增生等，即異常氣道重塑[2]。參與哮喘氣道重塑的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是研究最深入、最重要的細(xì)胞因子[3]，相關(guān)研究主要包括TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Sonic Hedgehog信號(hào)通路等[4-5]。哮喘動(dòng)物模型研究[6]顯示，c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路下游的信號(hào)分子可能與哮喘相關(guān)。本課題研究哮喘激發(fā)前、激發(fā)后第2、4、8周哮喘模型小鼠肺組織 TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）水平與氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，希望通過(guò)對(duì)TGF-β1/JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致的氣道重塑機(jī)制進(jìn)行深入研究，為哮喘的預(yù)防和治療找到新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 50%卵蛋白（OVA）（批號(hào)20140523，美國(guó)Sigma公司）；MMP-9試劑盒（批號(hào)20140125，美國(guó)Santa Cruz公司）；TIMP-1 ELISA 試劑盒（批號(hào) 20140328，上海晶美公司）；TGF-β1試劑盒（批號(hào)20140321，美國(guó)R&D公司）。美國(guó)BIO-TEK酶標(biāo)儀（型號(hào)：synergyh1）購(gòu)自山東龍美生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)：CT2-BI-200）購(gòu)自成都泰盟科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠 40 只，4～7 周齡，體質(zhì)量（17.56±1.89）g，購(gòu)自中國(guó)軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)∶SCXK（京）20140008。所有動(dòng)物均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范要求。動(dòng)物飼養(yǎng)條件和環(huán)境：全部小鼠可自由飲水和進(jìn)食，動(dòng)物飼養(yǎng)室保持溫度20℃～23℃，濕度35%～55%，晝夜循環(huán)為 12h/12h（8∶00am～8∶00pm），動(dòng)物籠具及飲食器具每周進(jìn)行清洗和定期消毒。40只小鼠隨機(jī)分為激發(fā)前組、第2周組、第4周組和第8周組，每組10只。

1.3 動(dòng)物模型復(fù)制 所有C57BL/6J小鼠均予50%卵蛋白1mL[含OVA 0.5mg和Al（OH）3（氫氧化鋁）50mg]腹腔內(nèi)注射5天，第2、4、8周組分別予2.5%卵蛋白生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)哮喘，每周3次，每次30min，連續(xù)2、4、8周。小鼠表現(xiàn)為煩躁不安、搔癢、喘鳴、腹肌抽搐等癥狀，繼而俯伏不動(dòng)，出現(xiàn)呼吸急促，呼吸困難，部分可聞及響亮的呼氣相喘鳴音，重者可出現(xiàn)呼吸不規(guī)則，反復(fù)激發(fā)后小鼠毛色失去光澤，精神不振和反應(yīng)遲鈍，表示造模成功[7]。

1.4 肺組織標(biāo)本制備[8]激發(fā)前和激發(fā)后第2、4、8周記錄各組小鼠呼吸頻率。第2、4、8周組小鼠均造模成功，分別于超聲霧化抗原激發(fā)開(kāi)始第2、4、8周提取肺組織標(biāo)本。標(biāo)本制備：采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40mg/kg），開(kāi)胸，取新鮮左肺組織提取mRNA和總蛋白，備Real time RT-PCR和Western blot檢測(cè)；剩余右肺支氣管肺組織應(yīng)用4%多聚甲醛行支氣管灌注固定，石蠟包埋，切片4μm，HE染色光鏡常規(guī)觀察、測(cè)量細(xì)支氣管管徑和管壁厚度。

1.5 蛋白質(zhì)純化和免疫印跡（Western blot）檢測(cè)[9]采用 Western blot檢測(cè) TGF-β、1MMP-9、TIMP-1 分子的蛋白質(zhì)水平，應(yīng)用一步法提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，統(tǒng)一蛋白濃度后，分裝-80℃保存。取50μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉、結(jié)合一抗、二抗，最后以ECL顯影。用NIH Scion Image軟件半定量分析蛋白質(zhì)表達(dá)量。每組均重復(fù)2次。RT-PCR引物序列：TGF-β1上游引物：5’-CGGCAGCTGTACATTGACTT-3’；下游引物：5’-TCAGCTGCACTTGCAGGAGC-3’；MMP-9 引物序列：上游5'-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'；下游 5'-GGCACAGTAGTGGCCGTAG-3'；TIMP-1 引物序列：上游：5'-TTCCACAGGTCCCACAAC-3'，下游：5'-CGTCCACAAGCAATGAGT-3'。

1.6 氣道形態(tài)學(xué)變化測(cè)量[10]HE染色后，光鏡觀察（觀察倍數(shù)10×40）：取5個(gè)完整的支氣管橫斷面，且氣管最小徑/最大徑≥0.5，應(yīng)用圖像分析軟件測(cè)定支氣管基底膜周徑（μm）、上皮黏膜層面積（μm2）、平滑肌面積（μm2）、氣管內(nèi)壁面積（μm2），并用支氣管基底膜周徑標(biāo)準(zhǔn)化，分別以上皮黏膜層面積/支氣管基底膜周徑、平滑肌面積/支氣管基底膜周徑、氣管內(nèi)壁面積/支氣管基底膜周徑衡量氣道重塑的程度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），均數(shù)兩兩比較采用LSD法；兩變量相關(guān)分析采用直線相關(guān)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織TGF-β1及MMP-9、TIMP-1比較 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織TGF-β1及MMP-9、TIMP-1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，激發(fā)第8周組顯著高于激發(fā)前組和激發(fā)后第2、4周組（P均＜0.01），見(jiàn)表1。

2.2 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較

不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織上皮黏膜層面積/支氣管基底膜周徑、平滑肌面積/支氣管基底膜周徑、氣管內(nèi)壁面積/支氣管基底膜周徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，激發(fā)第8周顯著高于激發(fā)前組和激發(fā)后第2、4周組（P均＜0.01），見(jiàn)表 2。

2.3 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織TGF-β1與MMP-9、TIMP-1與氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)相關(guān)性 氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)（上皮黏膜層面積/支氣管基底膜周徑、平滑肌面積/支氣管基底膜周徑、氣管內(nèi)壁面積/支氣管基底膜周徑）與肺組織TGF-β1與MMP-9、TIMP-1水平呈正相關(guān)（r=0.95、0.94、0.93；r=0.97、0.96、0.99；r=0.94、0.92、0.96，P＜0.01）。

3 討論

氣道炎癥和氣道重塑是目前哮喘公認(rèn)的兩個(gè)主要特征[10]。反復(fù)接觸變應(yīng)原刺激誘發(fā)支氣管哮喘急性發(fā)作及炎性因子的分泌及氣道重塑[11]。氣道重塑是哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)[12-13]。氣道重塑主要涉及到構(gòu)成氣道壁的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分及功能的改變，進(jìn)而導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的不完全可逆性改變，為哮喘的臨床治療帶來(lái)困難[14]。

表1 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織TGF-β1及MMP-9、TIMP-1比較（±s）

表1 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織TGF-β1及MMP-9、TIMP-1比較（±s）

注：與第8周比較，*P＜0.01；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1

組別激發(fā)前組第2周組第4周組第8周組鼠數(shù)10 10 10 10 F P呼吸頻率（次/分）121.82±10.29*181.84±12.31*212.38±13.46*248.35±15.28 135.15＜0.01 TGF-β1（pg/mL）174.17±46.44*229.00±53.09*318.26±84.53*419.37±107.53 124.42＜0.01 MMP-9（pg/mL）3128.64±126.73*8868.47±3544.42*6328.68±2874.37*4383.37±2498.53 253.34＜0.01 TIMP-1（pg/mL）1428.45±354.39*4783.29±1058.25*5328.26±2054.37*6542.38±3024.53 174.83＜0.01

表2 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較（×10-3μm，±s）

表2 不同激發(fā)時(shí)間小鼠肺組織氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較（×10-3μm，±s）

注：與第 8 周比較，*P＜0.01

組別激發(fā)前組第2周組第4周組第8周組鼠數(shù)10 10 10 10上皮黏膜層面積/支氣管基底膜周徑10.10±2.77*24.90±3.35*37.00±4.88*F P 45.00±5.88 6.25＜0.01平滑肌面積/支氣管基底膜周徑7.30±1.89*17.00±2.58*31.60±4.20*48.60±5.20 4.31＜0.01氣管內(nèi)壁面積/支氣管基底膜周徑15.10±2.81*28.20±5.18*37.10±8.82*53.10±11.82 11.09＜0.01

氣道重塑具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，TGF-β1是一種能夠?qū)е職獾乐厮艿闹匾橘|(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌，從而促進(jìn)血管生成、膠原合成、基質(zhì)沉積平滑肌細(xì)胞遷移及增生等多種途徑參與哮喘的發(fā)病進(jìn)程[15-16]。TGF-β1的表達(dá)水平增高還參與上皮下的纖維化和病理性的組織重構(gòu)[17]。研究[18-19]證實(shí)，TGF-β1在哮喘患者氣道上皮及黏膜下明顯增多,且其表達(dá)與氣道基底膜厚度、成纖維細(xì)胞數(shù)目和或哮喘發(fā)作的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

MMPs是哮喘氣道重塑的重要致病因素，其中MMP-2和MMP-9與哮喘的關(guān)系最為重要[20]。哮喘伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)的降解和膠原的沉積，膠原的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定決定于MMPs及其抑制物——TIMPs的平衡。周華斐等[8]發(fā)現(xiàn)，哮喘組大鼠中性粒細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9和血清基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1的表達(dá)均高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；張維溪等[19]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，哮喘組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均顯著高于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著激發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織TGF-β1顯著增高，MMP-9水顯著減少，而TIMPs顯著增高（P＜0.01）；氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)與哮喘小鼠肺組織 TGF-β1、MMP-9和 TIMPs水平呈正相關(guān)（P＜0.01）。提示哮喘氣道重塑與肺組織MMP-9和TIMPs表達(dá)水平可能存在正相關(guān)。

綜上所述，小鼠氣道重塑的存在可能是由于肺組織TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的過(guò)度表達(dá)引起，但是哮喘氣道重塑是一個(gè)多介質(zhì)、多因子參與的復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。