miR-16通過調節Bcl-2的表達活性影響胃癌細胞的生物學行為*

金向東 何旭華 葉盛威 劉洋劉山

(1.鄂州市第三醫院消化內科，湖北 鄂州 436000；2.湖北省腫瘤醫院胃腸外科， 湖北 武漢 430000； 3.武漢市第三醫院胸外科，湖北 武漢 430000)

胃癌(Gastric Carcinoma)是世界上第四大常見的惡性腫瘤，是全球因癌癥導致死亡的第二大原因[1]。近年隨著現代醫學的進步，治療胃癌戰略更加多元化[2]。胃癌生長和轉移的過程相當復雜，涉及大量致癌基因、抑癌基因和非編碼基因等[3]。分子靶向治療的興起，對于胃癌患者而言是一個重要的福音[4]。

miRNA是一類小型非編碼RNA的家族，其長度范圍從20～22個核苷酸不等[5]。越來越多的研究發現，miRNA在調節多種生物過程中起重要作用，如細胞分化、增殖、遷移和凋亡[6-9]。許多miRNA可直接作用于致癌基因和抑癌基因，調控其表達，從而影響腫瘤細胞的生物學行為[10]。

Bcl-2(B-cell lymphoma 2)是人類Bcl-2基因編碼的蛋白質，是調節細胞凋亡的Bcl-2家族的創始成員[11]。這是一個重要的抗凋亡蛋白[12]，但它并非屬于原癌基因，因為它并不是生長信號傳感器[13]。盡管存在部分相應的研究基礎，但在胃癌中miR-16和Bcl-2的相互關系及其調節機制仍然不清楚。在本研究中，我們通過探尋miR-16在胃癌SGC7901細胞中的表達及其與Bcl-2作用的分子機制，為胃癌的潛在治療靶點提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 胃癌細胞系SGC7901購自中國科學院(中國北京)，用含有10%的胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，Inc)的RPMI-1640培養基進行培養，加入100μg / ml青霉素和100μg/ ml鏈霉素(上海遠慕生物科技有限公司)，加濕，在37℃下含有5%的二氧化碳(CO2)中培養。

1.2 細胞轉染 miR-16 mimic、inhibitor和Bcl-2靶向siRNA在上海艾博思生物技術有限公司合成。將SGC7901細胞接種于6孔板中，并在37℃、95%空氣和5%CO2的潮濕空氣中培養過夜，使其融合度達到70%～90%。隨后根據 Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen，Carlsbad，California，United States)操作步驟進行轉染。

1.3 細胞活性評估 通過細胞計數試劑盒-8(CCK-8，Dojindo Molecular Technologies，Gaithersburg，MD)評估細胞活力。將SGC7901細胞懸液接種在96孔板中，在37℃、5%CO2中預培養24h。用miR-16 mimic、miR-16 inhibitor、Bcl-2 siRNA模擬對照和抑制劑對照轉染。48h后向培養基中加入10μlCCK-8溶液，培養物在37℃、5%CO2中孵育1h。使用酶標儀(Bio-Rad，Hercules，CA)在450nm處測量吸光度。

1.4 RNA提取和定量聚合酶鏈反應(PCR) 用Trizol Reagent(Invitrogen)法對轉染的細胞進行RNA提取。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa，中國大連)，將提取的RNA逆轉錄成cDNA，用SYBR Premix ExTaq TaKaRa與Stratagene Mx3000P PCR系統(Agilent Technologies，Inc，Santa Clara，CA，USA)進行定量PCR。GAPDH用作mRNA定量的內參。 通過2-ΔΔCT方法計算mRNA的相對表達率。每個基因重復反應3次。進行獨立實驗3次。

1.5 Western blotting 使用Radio Immunoprecipitation Assay(RIPA)裂解緩沖液(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)提取蛋白質，裂解液中加入蛋白酶抑制劑(Roche，Basle，Switzerland)。使用BCA TM蛋白質測定試劑盒(Pierce，Appleton，WI，USA)對蛋白質進行定量檢測。將等量的蛋白質進行凝膠(10%～12%SDS-PAGE)電泳，使用濕轉法將蛋白轉染至PVDF(Maibio，Shanghai，China)膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2h以上。并用以下一抗Bcl-2(ab32124)、pro-caspase-3 (ab32150)、cleaved caspase-3(ab13585)、pro-caspase-9 (ab32068)、GAPDH(ab8245, Abcam, Cambridge, UK) and cleaved caspase-9 (#9501; Cell signaling Technology)進行4℃孵育過夜。然后與二抗(1：5000，Abcam，USA)標記通過辣根過氧化物酶在室溫下培養1h，漂洗后，ECL發光。實驗重復3次。

1.6 細胞凋亡實驗 細胞凋亡采用FITC膜聯蛋白V凋亡檢測試劑盒(北京中國生物技術研究所)。將miR轉染的細胞再用PBS洗滌兩次，然后用5μl PI和10μl FITCAnnexin V中染色，在黑暗中37℃室溫中孵育1h。最后使用流式細胞儀FACS進行分析。

1.7 劃痕實驗 將胃癌SGC7901細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到90%時，用已滅菌消毒的200μl槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始位置及距離(0 time)后置于恒溫孵箱中孵育72h，再次測量劃痕的距離，并計算細胞的遷移率。細胞遷移率的計算公式=[遷移距離D(0h)-遷移距離D(72h)]/ 遷移距離D(0h)。實驗重復3次。

2 結果

2.1 miR-16在胃癌SGC7901細胞中的轉染效率 為確定miR-16是否參與胃癌腫瘤的發生，將miR-16mimic、miR-16inhibitor及其相應的對照分別轉染入SGC7901細胞。通過PCR檢測轉染效率，結果顯示，miR-16 mimic組表達明顯上調[(1.01±0.14)%vs(1.89±0.23)%，P<0.01]，而miR-16 inhibitor組顯著下調[(1.06±0.15)%vs(0.28±0.11)%，P<0.01]，見圖1。

2.2 miR-16對SGC7901細胞遷移和活性的影響 通過CCK-8劃痕實驗測定miR-16在SGC7901細胞上的生物學功能。miR-16過表達時SGC7901細胞的活性[(103.4±8.5)% vs(72.4±10.4)%，P<0.05]和相對遷移率[(98.8±10.8)% vs(67.6±11.5)%，P<0.05]遠低于對照組。而細胞活性 [(98.6±9.70) % vs(121.2±11.1)%，P<0.05]和相對遷移率[(104.5±11.0%)% vs(120.5±11.6)%，P<0.05]在miR-16 inhibitor組則高于對照組，表明miR-16能抑制SGC7901細胞遷移和活性,見圖2A、B。

2.3 miR-16對SGC7901細胞凋亡的影響 在miR-16過表達時，SGC7901細胞凋亡百分比顯著增加[(3.2±0.7)% vs(11.3±1.3)%，P<0.001]，而miR-16下調時對細胞凋亡沒有明顯影響[(3.3±0.3)% vs(3.5±0.9)%，P>0.05]，見圖3A。進行western blot檢測凋亡相關蛋白表達，結果顯示，miR-16 mimic激活凋亡相關蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-3的表達，而miR-16抑制時這些蛋白表達卻相反,且pro-caspase-3和procaspase-9的蛋白水平未被miR-16過表達或抑制所調控，見圖3 B。這些結果表明，miR-16可能是潛在的胃癌抑制基因，能誘導胃癌細胞SGC7901的凋亡。

圖1miR-16mimic，miR-16inhibitor及其相應的對照轉染入SGC7901細胞后miR-16的表達情況

Figure1TheexpressionofmiR-16mimic,miR-16inhibitoranditscorrespondingcontroltransfectedSGC7901cells

注：與mimic、inhibitor比較，①P<0.01

圖2 miR-16mimic、miR-16inhibitor及其相應的對照對細胞遷移和活性影響Figure 2 Effect of miR-16mimic, miR-16 inhibitor and their corresponding controls on cell migration and activity

注：與mimic、inhibior比較，①P<0.05

圖3 miR-16 對SGC7901細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的影響Figure 3 Effect of miR-16 on apoptotic cells rate and apoptosis-related proteins of SGC7901注：與mimic比較，①P<0.01

2.4 miR-16對Bcl-2表達的影響 為進一步探索miR-16在胃癌SGC7901細胞中對Bcl-2調控的影響，將miR-16mimic、miR-16inhibitor及其相應的對照轉染入SGC7901細胞，通過western blot檢測Bcl-2蛋白水平。結果表明，miR-16過表達后Bcl-2的表達明顯下調，而miR-16抑制后Bcl-2明顯上調，見圖4。故推測在胃癌中Bcl-2受到miR-16負性調節。

圖4miR-16mimic，miR-16inhibitor對Bcl-2蛋白表達的影響

Figure4EffectofmiR-16mimicandmiR-16inhibitoronBcl-2proteinexpression

2.5 Bcl-2對SGC7901細胞遷移和活性的影響 為進一步驗證Bcl-2是否參與miR-16對SGC7901細胞的調控，通過使用Bcl-2特異性siRNA用于沉默Bcl-2后與miR-16 inhibitor進行共同轉染。結果顯示，miR-16inhibitor轉染后SGC7901的細胞活性[(103.5±9.3)% vs(126.7±10.6)%，P<0.05]和遷移 [(100.1±10.4)% vs(132.3±11.9)%，P<0.05] 顯著增加，而與Bcl-2 siRNA共轉染后可以消除miR-16 inhibitor對細胞活性[(126.7±10.6)% vs(74.3±8.3)%，P<0.01]和遷移[(132.3±11.9)% vs(80.6±12.1)%，P<0.01]的促進作用，見圖5。說明Bcl-2能消除miR-16對SGC7901細胞遷移和活性的影響，反向驗證了miR-16對Bcl-2的調控作用。

圖5 Bcl-2 siRNA與miR-16inhibitor共轉后對SGC7901細胞遷移和活性的影響Figure 5 The migration and activity after Bcl-2 siRNA co-transfection with miR-16 inhibitor on SGC7901 cell 注：A.與inhibitor、inhibitor+si-Bcl-2比較，①P<0.05；B.與inhibitor control、inhibitor+si-Bcl-2比較，②P<0.001

2.6 Bcl-2對SGC7901細胞凋亡的影響 結果顯示，miR-16 inhibitor與Bcl-2 siRNA共轉染后，凋亡細胞明顯增加[(3.4±0.5)% vs(12.2±0.9)%，P<0.001]，見圖6A。western blot分析結果顯示，與miR-16inhibitor相比，miR-16inhibitor與Bcl-2siRNA共轉染后會活化cleaved caspase-3和cleaved caspase-3的表達，但pro-caspase-3和procaspase-9的蛋白水平無明顯變化。這些結果表明，Bcl-2可改變miR-16對SGC7901細胞凋亡的影響，見圖6B。

圖6 Bcl-2 siRNA與miR-16inhibitor共轉后對SGC7901細胞凋亡的影響Figure 6 The effect of apoptosis after Bcl-2 siRNA co-transfection with miR-16 inhibitor on SGC79013注：與inhibitor +si-Bcl-2比較，①P<0.01

3 討論

對于胃癌患者而言，特別是晚期患者，傳統的二聯或三聯細胞毒性化療方案的中位生存期約為9～11個月[14]。雖然聯合化療較單藥化療能一定程度上提高腫瘤緩解率和總體生存率，但聯合用藥也顯著增加化療的毒性[15]。來自基因表達譜的數據表明，胃癌的病理和臨床表現的差異可能是由于獨特的分子表型所導致的[16]。近些年來，學者們發現了胃癌的各類分子靶向藥物，并應用于治療中，包括靶向HER2、EGFR、MET、FGFR、PI3K / MTOR和血管生成通路的藥物[17]。例如，用曲妥珠單抗治療HER2陽性的胃癌已經導致總體存活率的顯著增加[18]。與傳統的治療模式相比，這些新的靶向分子能顯著提高患者的生存獲益。

目前越來越多的證據表明，非編碼miRNA可能參與腫瘤的發病機制，其功能和潛在應用已成為目前研究熱點[19]。miR-16與人類癌癥相關，包括乳腺癌、結腸直腸腺癌、肺癌等[20-22]發病和發展有關。有研究表明，miR-16能通過在非小細胞肺癌細胞中激活自噬來抑制TGF-β1誘導的上皮-間質轉化[23]。還有研究表明，miR-16還能通過抑制癌基因BMI1誘導乳腺癌細胞中的線粒體依賴性細胞凋亡[24]。但是miR-16在胃癌中的作用機制，以及對胃癌細胞的增殖、遷移和凋亡的影響尚未得到深入的研究。在本研究中我們證明了miR-16的過表達抑制胃癌SGC7901細胞的活力和遷移，并促進細胞凋亡，起到抑癌的作用。這也印證了文獻中miR-16的作用方式。

Bcl-2基因在細胞存活和凋亡抑制中起關鍵作用。許多研究已經表明，Bcl-2可以被幾種miRNA調控。目前已經確定Bcl-2基因的損傷導致了多種惡性腫瘤的發生，包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、慢性淋巴細胞白血病和肺癌等[25-29]。XU等研究發現，MicroRNA-19a能抑制鼻咽癌CNE1細胞活力和遷移，而且是通過抑制Bcl-2而誘導細胞凋亡[30]。SHEN等在體外證明，miR-16通過體外靶向Bcl-2誘導大鼠活化的胰腺星狀細胞凋亡[31]。然而沒有足夠的信息證明miR-16調節Bcl-2在胃癌中的作用。因此，我們的研究首次揭示了在胃癌中miR-16和Bcl-2之間的潛在關系。實驗結果證明，miR-16能抑制Bcl-2蛋白的表達。此外，Bcl-2的沉默可以消除miR-16抑制對細胞活性和遷移的促進作用，并可促進細胞的凋亡，而Bcl-2在胃癌SGC7901中被miR-16反向調節。

4 結論

本研究表明，miR-16能抑制細胞活性和遷移，誘導胃癌SGC7901細胞凋亡，因此miR-16可能是潛在的胃癌抑制基因。此外，miR-16可能通過靶向調控Bcl-2發揮對SGC7901細胞的作用。這些結果提示miR-16在治療胃癌中發揮一定作用，可能是潛在的胃癌抑制基因，有望成為下一個治療胃癌的新靶點。