膽汁酸代謝異常與肝硬化并發膽囊結石的關系分析*

高聰 張宇 陳云飛 劉兵

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 1.急診外科，2.肝膽外科，四川 成都 610072)

肝硬化是飲食、精神狀態及代謝性疾病等致病因素長期反復作用于肝臟導致的慢性肝損害，患者易并發膽囊結石。在我國，膽囊結石發病率約為10%，而肝硬化并發膽囊結石患者因全身狀況不佳不允許手術，藥物治療療效差或反復發作，因此預防肝硬化患者發生膽囊結石需從其病理方面深入研究[1-2]。膽汁中成分改變為膽囊結石形成的重要原因，當膽汁酸減少時，可直接或間接影響膽汁中膽固醇狀態，形成結石[3]。膽汁中膽汁酸、磷脂、直接膽紅素(Direct bilirubin,DBIL)等的分泌受法尼醇受體(FXR)、膽鹽輸出泵(BSEP)、多耐藥相關蛋白(MRP)的調節，其中FXR作為膽汁酸受體可調節膽汁酸合成、轉運、代謝及重吸收，減少膽汁淤積[4-5]。Wang YD等[6]的研究發現，肝臟細胞中的胞質為BSEP的儲存庫，其BSEP量為肝細胞膽管側膜的6倍，體內BSEP主要通過肝細胞膽管膜轉運膽鹽，而減少肝臟內膽汁潴留、瘀積，且FXR可調節BSEP、MRP活性[7]。因此，本研究在既往研究基礎上，推測FXR、BSEP、MRP引起的膽汁酸代謝異常可能與肝硬化并發膽囊結石有關，旨在為預防肝硬化并發膽囊結石提供病理依據，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年4月～2017年5月我院收治的肝硬化并發膽囊結石患者40例、單純膽囊結石患者36例。納入標準：①肝硬化患者依據肝炎病史及血清乙肝病毒感染標記陽性，且具有肝硬化臨床表現、生化與影像學輔助檢查證實為肝硬化，并于術中行肝臟活檢，病理證實為肝硬化。②所有患者均經CT或腹部超聲明確有膽囊結石。③麻醉分級(ASA)Ⅰ～Ⅱ級，且同意術后留取標本并簽署知情同意書。排除標準：①梗阻性黃疸、合并膽總管結石、肝內膽管結石及其他膽道疾病者。②有肝切除術或膽道手術史。③合并全身免疫系統疾病或近1周服用過熊去氧膽酸、利膽藥者。將肝硬化并發膽囊結石患者納入研究組，單純膽囊結石患者納入對照組，研究組中男性18例，女性22例，年齡18～60歲，平均(38.56±4.11)歲，ASA分級：Ⅰ級21例，Ⅱ級19例；對照組中男性17例，女性19例，年齡19～58歲，平均(38.50±4.15)歲，ASA分級：Ⅰ級19例，Ⅱ級17例，兩組在性別、年齡、ASA分級等一般資料方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究征得我院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 研究方法

1.2.1 術前檢查及標本采集 均于手術前1d抽血化驗生化全項目，統計其總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總膽汁酸(TBA)，術中切取肝緣約1.0cm2肝組織，采集標本后立即保存于福爾馬林液中，并在24h內制成石蠟切片。

1.2.2 主要試劑及配制 兔抗人FXR多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：100)，兔抗人BSEP多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：100)，兔抗人MRP2多克隆抗體(濃縮型，工作液濃度1：80)，均購自北京奧森生物技術有限公司；SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.3 FXR、BSEP、MRP2表達水平測定 以4%多聚甲醛固定，銅制模具包埋組織塊，后切片、脫蠟、阻斷內源性過氧化物酶活性、抗原修復、甩去多余液體、滴加第一抗體、滴加生物素化第二抗體、滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色、蘇木素復染細胞核7(8s，后置于×400倍顯微鏡下觀察。應用美國IMAge-Pro Plus v5.1軟件，捕獲顯微鏡采集的組織形態學圖片，選取其中陽性表達最強的5個視野進行計算，記錄陽性細胞數及陽性細胞顯色強度，得出SP評分(IHS)的數值。SP免疫組化圖像評分標準：①陽性細胞數分級：0.0%～1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計4分，81%～100%計4分。②陽性細胞顯色強度：0分：未染黃色，陰性；1分：淡黃色，弱陽性；2分：黃色，陽性；3分：棕黃色，強陽性；IHS評分為①、②評分乘積。

1.3 觀察指標 ①對比兩組術前一天血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平。②比較兩組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達水平。③分析上述指標相關性。

2 結果

2.1 兩組血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比較 與對照組比較，研究組DBIL、TBA明顯較高，TC、TG較低(均P<0.05)，而TBIL對比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組血清TBIL、DBIL、TC、TG、TBA水平比較Table 1 The levels of serum TBIL, DBIL, TC, TG and TBA in the two groups

2.2 兩組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達水平比較 研究組肝臟組織FXR、BSEP、MRP2表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.3 血清生化指標FXR、BSEP、MRP2相關性分析 結果顯示，肝硬化并發膽囊結石患者FXR、BSEP、MRP2與DBIL、TBA呈負相關，且FXR與BSEP、MRP2均存在正相關關系(P<0.05)，見表3。

Table2LivertissueFXR,BSEPandMRP2expressionlevelsinthetwogroups

組別nFXRBSEPMRP2研究組402.15±0.344.21±0.514.35±0.56對照組369.21±1.029.24±1.129.81±1.06t41.32525.61928.474P0.0000.0000.000

表3 血清生化指標FXR、BSEP、MRP2相關性分析Table 3 Correlation analysis of serum biochemical indexes, FXR, BSEP and MRP2

2.4 SP染色結果 研究組局部肝細胞水腫，脂肪變性，結締組織增生，炎細胞浸潤，主要定位于細胞質中，細胞核也有少量表達，且研究組FXR、BSEP、MRP2表達均低于對照組，見圖1～3。

圖1 研究組、對照組FXR SP染色(×400)Figure 1 FXR SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對照組

圖2 研究組、對照組BSEP SP染色(×400)Figure 2 BSEP SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對照組

圖3 研究組、對照組MRP2 SP染色(×400)Figure 3 MRP2 SP staining in the study group and control group (x400)注：a為研究組，b為對照組

3 討論

膽囊結石為臨床外科常見病，患者常因膽絞痛、急性膽囊炎而就診，嚴重者可出現膽囊壞疽、穿孔，膽囊結石一旦進入膽總管內，可致急性膽管炎、急性胰腺炎等，嚴重者危及生命[8]。膽囊結石的發生與肝硬化程度及病程密切相關，王子晨等[9]的調查結果顯示，肝硬化患者合并膽囊結石發生率為21.3%，明顯高于正常體檢者單純膽囊結石發生率的5.6%，且肝功能分級、DBIL、TG等是肝硬化并發膽囊結石的危險因素，因而探討肝硬化患者并發膽囊結石的發病機制有助于改善其肝功能，減少結石形成率[10]。膽汁酸為膽汁重要成分，經肝臟合成后分泌至膽囊或腸道中，正常情況下膽汁中膽固醇、膽汁酸及磷脂維持一定比例的動態平衡，而肝硬化時，肝細胞受損，肝內酶不足，膽固醇向膽汁酸轉化減少，使膽汁酸分泌減少，膽汁酸的減少也會使膽固醇溶解降低，膽固醇從膽汁中析出結晶，形成膽固醇結石，同時膽汁酸也是膽紅素重要助溶劑，膽汁酸含量降低時將影響膽汁中游離膽紅素溶解度，使膽汁酸與鈣離子結合力減小，繼而形成膽色素結石，因此肝硬化患者膽汁中膽汁酸濃度的改變為膽囊結石形成創造了條件，對研究膽汁酸代謝異常機制有重要意義[11-12]。膽汁形成及分泌與肝細胞轉運蛋白密切相關，其中一些蛋白如轉運膽鹽的轉運子BSEP、MRP2等在膽囊結石形成中的作用已在動物實驗中得到充分印證[13-14]，但BSEP、MRP2與人體膽囊結石尤其是肝硬化并發膽囊結石的關系研究較少[15]。孔凡民等[16]的研究發現，膽囊結石患者的肝組織中BSEP、MRP2表達較正常肝組織減少，光密度平均值分別為(0.47±0.18)、(1.12±0.39)，提示BSEP、MRP2在人體膽囊結石形成中發揮作用。FXR則是主要表達于肝臟的典型核受體結構，DNA結合域與靶基因上FXR反應元件結合后發揮轉錄調節作用，其活化可負反饋調節膽汁酸合成，Liu J等[17]在分析膽汁酸對原代肝細胞膽汁酸合成和轉運基因表達的影響時發現，在膽汁酸限速酶存在時，FXR作為主要靶基因有增加趨勢，同時膽汁酸吸收轉運Na+牛磺膽酸共轉運多肽不受影響，而BSEP提高了15倍，MRP2也增加，可見FXR、BSEP、MRP2均可能參與膽汁酸代謝調控。

本次研究在既往研究基礎上，分析了肝硬化合并膽囊結石患者(研究組)、單純膽囊結石患者(對照組)在術前一天血清生化指標及FXR、BSEP、MRP2表達水平。結果顯示，研究組血清DBIL、TBA明顯高于對照組，而TC、TG明顯低于對照組，且研究組FXR、BSEP、MRP2均較對照組低，這與張亮亮等[18]的報道結果相近，證實肝硬化并發膽囊結石患者存在明顯的膽汁酸代謝異常。原因在于肝細胞血竇面基底膜上轉運蛋白，包括有機陰離子、BSEP、MRP2等轉運膽汁相應成分進入肝細胞內，再經與蛋白質結合或細胞內擴散方式運輸至肝細胞毛細膽管膜，后進入毛細膽管內，形成膽汁；當肝硬化時，膽鹽超載，FXR參與肝細胞毛細膽管膜上MRP2轉錄的上調；FXR的活化還可誘導BSEP、MRP2表達，促進膽汁酸及DBIL分泌，調節膽汁成分；此外，在快速循環轉運過程中，BSEP可能通過降解磷酸化、糖基化、泛酸化等蛋白質修飾作用而保護自己，以避免被降解。同時因FXR的下調致BSEP、MRP2表達減少，肝臟分泌DBIL入膽汁的能力受損，使DBIL升高，血清生化檢測可觀察到TBIL、DBIL、TBA等異常[19]。國外學者Chen WD1等[20]的研究證實，FXR在膽酸激活下，通過與FXR形成異二聚體，繼而與BSEP及MRP2啟動子區的IR-1結合來調節基因轉錄。而本研究結果顯示，肝硬化合并膽囊結石患者FXR與BSEP、MRP2存在正相關性，進一步論證了FXR、BSEP及MRP2在膽汁酸代謝異常中的相互作用關系。

4 結論

本研究結果顯示，膽汁酸代謝異常是肝硬化患者并發膽囊結石的主要病理機制，可據此開展治療預防肝硬化并發膽囊結石。