“調(diào)臟通絡(luò)”電針對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用

潘 鴻，王宇峰，黃海鵬，張麗穎，鐘 禎，馬詩棋，董 理，王洪峰

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，吉林 長春 130117；2.北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，北京100018；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所，吉林 長春 130117)

糖尿病周圍神經(jīng)病(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是一種由糖尿病引起的以自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)癥狀為主要臨床表現(xiàn)的慢性并發(fā)癥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[1]證明:在糖尿病的諸多并發(fā)癥中，以DPN最為兇險。DPN發(fā)病機(jī)制尚不明確，高血糖、多元醇途徑、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和神經(jīng)生長因子等多種因素在DPN的發(fā)病過程中均起重要作用[2-6]。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)作為一種新的細(xì)胞凋亡途徑受到了廣泛重視。研究[7]顯示：ERS標(biāo)志性蛋白坐骨神經(jīng)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)在DPN大鼠坐骨神經(jīng)中存在過度表達(dá)。目前西醫(yī)治療DPN主要采取控制血糖、改善微循環(huán)和營養(yǎng)神經(jīng)等措施，其療效不明顯，且藥物不良反應(yīng)大[8]。相比之下，中醫(yī)治療尤其是電針療法日益凸顯其優(yōu)勢。中醫(yī)治療具有療效確切、安全方便以及從整體、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)作用等優(yōu)點(diǎn)。因此，本文作者采用“調(diào)臟通絡(luò)”電針法干預(yù)糖尿病大鼠，檢測其對GRP78表達(dá)的影響，探討ERS介導(dǎo)的周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡在DPN發(fā)病中的作用，為臨床治療DPN提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級成年雄性SD大鼠86只,體質(zhì)量180～220 g,購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司,動物許可證編號:SCXK(遼)2015-0001。大鼠分籠飼料喂養(yǎng)，恒溫21℃～25℃，濕度40%～70%，每日光照12 h，噪音<60 DB，喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行分組。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，甲鈷胺膠囊(江蘇德源藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.5 mg)，GRP78抗體(英國Abcam公司)，山羊血清(上海源葉生物科技有限公司)，抗原修復(fù)液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Hoechest33342 ( 英國Abcam公司)，組織裂解液(美國Thermo公司)。BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀和濕電轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio Rad公司)， 垂直電泳槽(英國Abcam公司)，ECL化學(xué)發(fā)光液試劑盒(上海天能科技有限公司)，TUNEL試劑盒(英國Abcam公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型制備 將86只大鼠分為正常對照組(n=5)和造模組(n=81)。造模組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前檢測空腹血糖值1次，所有大鼠空腹血糖值均小于5.8 mmol·L-1。造模組大鼠在造模前禁食(不禁水)12 h后稱體質(zhì)量，按50 mg·kg-1一次性腹腔注射1%STZ溶液，制備糖尿病模型。糖尿病模型成模標(biāo)準(zhǔn)為2次隨機(jī)血糖值≥16.7 mmol·L-1，共79只大鼠造模成功。于糖尿病成模時(干預(yù)前)及干預(yù)12周后測定大鼠脛神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組和干預(yù) 糖尿病大鼠造模成功后，將79只成模大鼠隨機(jī)分為模型對照組(n=27)、藥物干預(yù)組(n=26)和電針干預(yù)組(n=26)。模型對照組：造模成功后，同等條件下飼養(yǎng)，不采取任何特殊處置，僅作對照觀察。藥物干預(yù)組：采取甲鈷胺灌胃，20 mg·kg-1·d-1，每日1次，連續(xù)干預(yù)12周。 電針干預(yù)組：取雙側(cè)肺俞、脾俞、腎俞、合谷、足三里、三陰交和太沖，予以“調(diào)臟通絡(luò)”電針進(jìn)行干預(yù)，選用華佗牌SDZ-V型電針儀，以同側(cè)的肺俞-腎俞、三陰交-太沖為電針連接對穴，取疏密波(頻率比為1∶5)，設(shè)置疏波頻率為3 Hz，強(qiáng)度以刺激部位肌肉輕微收縮且大鼠能夠耐受為度,每日1次，每次20 min，6次為1個療程，療程間休息1 d，連續(xù)干預(yù)12周。腧穴定位參照國家十二五規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]中大鼠針灸穴位圖譜進(jìn)行定位，具體位置：肺俞，第3胸椎下兩旁肋間；脾俞，第12胸椎下兩旁肋間；腎俞，第2腰椎下兩旁；合谷，前肢第1和第2掌骨之間；太沖，第1和第2跖骨間；足三里，膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處，在脛、腓骨間隙中；三陰交，后肢內(nèi)踝尖直上10 mm。肺俞、脾俞、腎俞采用0.5寸毫針，直刺6 mm；合谷采用0.5寸毫針，直刺1 mm；太沖采用0.5寸毫針，直刺1 mm；足三里(后三里)采用0.5寸毫針，直刺7 mm；三陰交采用0.5寸毫針，直刺5 mm。 正常對照組為“1.3”中未經(jīng)造模、同等條件下飼養(yǎng)的大鼠。

1.5 大鼠熱敏感度值的測定 將大鼠放入52 ℃的RCY-2熱板測痛儀(河北醫(yī)科大學(xué)儀器廠)中,從大鼠雙后足接觸熱板到出現(xiàn)抬后足、突然搖晃身體或者舔足的時間作為熱敏感度值指標(biāo)。每次重復(fù)測定3次, 時間間隔5 min。于造模前、成模時及干預(yù)4和12周后測定大鼠平均熱敏感度值。

1.6 大鼠脛神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定 各組大鼠給予水合氯醛腹腔注射麻醉，使用神經(jīng)肌電圖誘發(fā)電位儀,在左側(cè)坐骨神經(jīng)切跡處采用雙極針電極刺激左側(cè)坐骨神經(jīng)和脛神經(jīng)遠(yuǎn)端至膝部，在腓腸肌部連接接收電極，尾骶部連接接地電極；在距離接收電極約0.5 mm處連接參考電極，脈沖12.8 mA、0.1 ms。測量刺激電極到接收電極的距離，測定脛神經(jīng)的運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity,MCV)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(sensory nerve conduction velocity,SCV)。于成模時(干預(yù)前)及干預(yù)12周后各測定1次。

1.7 透射電鏡觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu) 針刺干預(yù)后，取大鼠坐骨神經(jīng)于2.5%戊二醛溶液中固定過夜，磷酸緩沖液漂洗樣品3次，采用1%鋨酸固定樣品1～2 h，梯度乙醇脫水，采用丙酮處理20 min，Epon812包埋劑梯度滲透，將樣品置于Eppendorf管中包埋，于70℃過夜，包埋塊呈黃色透明狀，采用LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)半薄切片定位，經(jīng)醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色后于JEM-1200EX型透射電子顯微鏡下觀察、拍片。

1.8 TUNEL法檢測各組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 常規(guī)方法進(jìn)行石蠟切片脫蠟，PBS洗滌3 min；快速將稀釋的蛋白酶K滴加在組織上后采用PBS洗滌5 min；30%H2O2與甲醇按1∶10的比例稀釋成3%H2O2，覆蓋組織后采用PBS沖洗5 min；采用TdT Equilibration和TdT Enzyme(試劑盒提供)進(jìn)行平衡對消、標(biāo)記反應(yīng)；加入DAB工作液進(jìn)行顯色后進(jìn)行蘇木精染核，脫水、封片后，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.9 免疫熒光法檢測各組大鼠坐骨神經(jīng)中GRP78表達(dá) 將坐骨神經(jīng)石蠟切片脫蠟，依次浸入二甲苯、無水酒精、酒精、蒸餾水和PBS緩沖液中。將切片置于0.1 mol·L-1、pH=6.0的檸檬酸抗原修復(fù)液中，微波后取出，自然冷卻至室溫，采用PBS洗滌。采用山羊血清室溫封閉孵育40 min。滴加一抗(1∶200稀釋)，滴加熒光二抗(1∶400稀釋)，取片， Hoechest染核，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)中GRP78的表達(dá)情況。

1.10 Western blotting法檢測各組大鼠坐骨神經(jīng)中GRP78表達(dá)水平 稱取約50 mg大鼠坐骨神經(jīng)組織樣本，加入200 μL組織裂解液，渦旋振蕩器震蕩，冰上裂解，4℃ 、14 000 g離心5 min,取上清液，采用BCA法(二辛可酸法)進(jìn)行蛋白定量。配制SDS-PAGE，加樣電泳、轉(zhuǎn)膜。采用TBST室溫洗膜后，一抗孵育(GRP78、Actin與TBST按1∶1 000稀釋)，二抗孵育(與5%脫脂奶粉按1∶2 000稀釋)。TBST洗膜，取出后加入ECL化學(xué)發(fā)光液(試劑盒提供)，置于顯影儀中曝光1 min顯影。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠熱敏感度值 糖尿病模型制備成功后，隨著病程延長，大鼠熱敏感度值逐漸降低。造模前和成模時，各組大鼠熱敏感度值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)4和12周后，與模型對照組比較，藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠熱敏感度值均明顯升高(P<0.01)；干預(yù)4周后，藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠熱敏感度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)12周后，與藥物干預(yù)組比較，電針干預(yù)組大鼠熱敏感度值明顯升高(P<0.01)。造模前與成模時各組大鼠組內(nèi)熱敏感度值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)4和12周后，模型組、藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠熱敏感度值較造模前及成模時均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠熱敏感度值

Group nThermal sensitivity value Before modelingModeling 4 weeks after intervention12 weeks after interventionNormal control 57.09±0.477.13±0.677.22±0.557.49±0.48Model control 27 7.26±0.846.13±0.554.06±0.86△2.82±0.20△Medicine intervention 267.39±0.806.12±0.455.19±1.01*#○3.91±0.58*#○Electroacupuncture inter-vention 267.20±0.636.19±0.655.02±0.57*#○5.67±0.60*△#○

*P<0.01vsmodel control group;△P<0.05vsmedicine intervention group;#P<0.05vsbefore modeling;○P<0.05vsmodeling.

2.2 各組大鼠脛神經(jīng)MCV 和SCV 干預(yù)前各組大鼠脛神經(jīng)MCV 和SCV比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)12周后組間比較：與模型對照組比較，藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠脛神經(jīng)MCV和SCV升高(P<0.01)；與藥物干預(yù)組比較，電針干預(yù)組大鼠脛神經(jīng)MCV 和SCV升高，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組內(nèi)比較：與干預(yù)前比較，干預(yù)12周后各組大鼠脛神經(jīng)MCV 和SCV均明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu) 正常對照組大鼠坐骨神經(jīng)可見粗細(xì)不等的有髓神經(jīng)纖維，神經(jīng)軸索內(nèi)電子密度均勻，髓鞘結(jié)構(gòu)完整包繞在軸突外,髓鞘板層規(guī)則排列，髓鞘結(jié)構(gòu)完整致密、均勻規(guī)則。模型對照組可見部分髓鞘板層疏松呈不規(guī)則的膜樣團(tuán)塊, 多見較粗的有髓神經(jīng)纖維受累嚴(yán)重。藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)上述改變均減輕，有些神經(jīng)纖維仍可見局部的板層分離現(xiàn)象。見圖1。

表2 各組大鼠脛神經(jīng)MCV 和SCV

Group nMCVBefore intervention 12 weeks after interventionSCV Before intervention 12 weeks after interventionNormal control550.67±10.7150.86±11.0451.26±8.9348.32±12.01Model control 2745.00±9.4420.63±10.2746.28±11.65 21.43±11.51Medicine intervention 2643.90±8.5620.67±11.38*△47.11±9.9526.73±10.77*△Electroacupuncture intervention 2643.84±9.1430.26±8.96*△45.13±9.4929.54±9.39*△

*P<0.01vsmodel control group;△P<0.01vsbefore intervention.

A:Normal control group;B: Model control group;C:Medicine intervention group;D:Electroacupuncture intervention group.

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 由于凋亡的細(xì)胞核內(nèi)DNA斷裂，暴露出3′端-OH，在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，加上HRP標(biāo)記的dUTP，經(jīng)過DAB后細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，因此凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕色，細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色。藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞分布介于正常對照組及模型對照組之間；與正常對照組比較，模型對照組、藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.01),藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2(插頁一)和表3。

2.5 免疫熒光法檢測各組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)情況 免疫熒光法檢測可見：GRP78(紅色)蛋白主要分布在神經(jīng)髓鞘上。與正常對照組比較，模型對照組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)(即熒光強(qiáng)度)明顯增強(qiáng)；與模型對照組比較，藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)(即熒光強(qiáng)度)明顯減弱；藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)無明顯差異。見圖3(插頁一)。

2.6 各組大鼠坐骨神經(jīng)中GRP78表達(dá)水平 與正常對照組比較，模型對照組、藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)中GRP78表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；藥物干預(yù)組和電針干預(yù)組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表3。

Lane 1：Normal control group；Lane 2：Model control group；Lane 3：Electroacupuncture intervention group；Lane 4：Medicine intervention group.

圖4 各組大鼠坐骨神經(jīng)中GRP78表達(dá)電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of GRP78 in sciatic nerve cells of rats in various groups

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)水平

GroupnApoptotic rateGRP78Normal control 50.084±0.0220.21±0.05Model control270.342±0.130**0.48±0.18*Medicine intervention260.129±0.013**△0.32±0.10*△Electroacupunc-ture intervention 260.138±0.020**△0.29±0.07*△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group；△P<0.05vsmodel control group.

3 討 論

DPN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一。該病具有起病隱匿和發(fā)生率高的特點(diǎn)，但其機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入研究DPN發(fā)病機(jī)制及其保護(hù)效應(yīng)對于日后臨床預(yù)防和治療DPN具有重要指導(dǎo)意義。研究[10]證實(shí)：STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠造模成功后1～2個月可以發(fā)展成DPN，本文作者在糖尿病成模后即給予“調(diào)臟通絡(luò)”電針干預(yù)，以觀察“調(diào)臟通絡(luò)”電針對DPN大鼠熱敏感度值、脛神經(jīng)MCV和SCV的影響。

GRP78屬于熱休克蛋白70(HSP70) 家族成員, 是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上最多的分子伴侶蛋白，ERS時通過未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP78大量表達(dá),被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性分子[11-12]。實(shí)驗(yàn)[13]表明:GRP78作為ERS的標(biāo)志性蛋白在DPN大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞中存在過度表達(dá)，具有協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)和減輕ERS的作用。GRP78的C末端可與蛋白折疊中間產(chǎn)物的疏水區(qū)域結(jié)合,N末端具有ATP酶活性,通過水解ATP的耗能過程防止蛋白質(zhì)聚集并促進(jìn)其折疊以獲得正確的空間構(gòu)象并維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài),以減輕ERS[14]。

本研究采用STZ誘導(dǎo)建立DPN大鼠模型，采用免疫熒光和Western blotting法進(jìn)行檢測，以肺俞、脾俞、腎俞、足三里、三陰交、合谷和太沖為主穴，行“調(diào)臟通絡(luò)”電針刺激。本研究結(jié)果表明：在DPN疾病進(jìn)程中，大鼠熱敏感度值和坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)端脛神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低，坐骨神經(jīng)細(xì)胞中GRP78表達(dá)水平明顯升高，經(jīng)“調(diào)臟通絡(luò)”電針治療后坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和GRP78表達(dá)水平明顯低于模型對照組，有髓神經(jīng)纖維板層分離現(xiàn)象減輕,提示“調(diào)臟通絡(luò)”電針對神經(jīng)凋亡保護(hù)的效應(yīng)之一可能是通過減少GRP78表達(dá)，從而抑制ERS的發(fā)生，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，改善板層分離現(xiàn)象。但目前關(guān)于GRP78的治療作用機(jī)制尚未明確。關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等研究[15-17]顯示：GRP78對細(xì)胞起保護(hù)作用,延長各種不利因素刺激下的細(xì)胞生存期,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Ermakova等[18]發(fā)現(xiàn)：GRP78一方面通過細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊，靶向降解錯誤折疊蛋白發(fā)揮分子伴侶作用；另一方面，GRP78表達(dá)水平上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡,可能與結(jié)合并抑制雌激素受體(ER)上的促凋亡受體有關(guān)，有助于細(xì)胞抵抗應(yīng)激,維持細(xì)胞存活。Ranganathan等[19]發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞內(nèi)給予p38MAPK特異性激動劑后，GRP78表達(dá)水平明顯升高，提示P38MAPK途徑可能參與了細(xì)胞表達(dá)調(diào)控過程，在細(xì)胞生長、應(yīng)激和炎癥抑制等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：GRP78在ERS介導(dǎo)坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡中存在過度表達(dá)，在DPN發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用。同時本研究選擇“調(diào)臟通絡(luò)”電針療法作為治療DPN主要思路，結(jié)合辯證選穴和近部選穴的選穴原則[20]，形成電針最優(yōu)治療方案。本文作者認(rèn)為：“調(diào)臟通絡(luò)”電針可以改善脛神經(jīng)傳導(dǎo)速度及周圍神經(jīng)病理形態(tài),降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，減少GRP78表達(dá)，從而對坐骨神經(jīng)起保護(hù)作用，說明“調(diào)臟通絡(luò)”電針對DPN大鼠周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制可能是通過抑制ERS而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，“調(diào)臟通絡(luò)”電針療法可以減少DPN坐骨神經(jīng)細(xì)胞中 GRP78表達(dá)。本研究結(jié)果既為“調(diào)臟通絡(luò)”電針的臨床應(yīng)用提供了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為以ERS為靶點(diǎn)的DPN治療提供了新的策略和科學(xué)依據(jù)。GRP78表達(dá)水平降低是通過何種途徑、電針干預(yù)是否為GRP78表達(dá)水平降低的直接原因是未來研究的重點(diǎn)。