海馬齒狀回區多巴胺D1受體在大鼠主動回避學習中的作用及其機制

王瑋瑤， 張 巖 ，趙 可 ，孫傳博，金清華

( 1. 延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉 133002；2. 吉林醫藥學院病理學教研室，吉林 吉林 132021)

哺乳動物的海馬可參與包括學習和記憶過程在內的多種高級腦功能。研究[1-2]顯示：海馬參與不同種類的學習與記憶形成過程，如空間學習、物體識別和厭惡性動機學習等，尤其在各種回避性學習中海馬是必不可少的。海馬主要由CA1～CA3和齒狀回(dentate gyrus，DG)構成，每個亞區在學習記憶中有不同的作用，而DG區作為新信息進入海馬的傳入點在海馬的學習記憶功能中起關鍵作用。突觸效應的長時程增強(long-term potentiation，LTP)是中樞神經系統中突觸可塑性的典型表現，是海馬依賴性學習過程的重要神經生理學機制[3-4]，而將學習記憶中出現的、與學習記憶能力間存在平行關系的LTP樣變化稱之為“習得性LTP”(learning-dependent LTP，LD-LTP)。在產生和維持海馬LTP的過程中，谷氨酸(glutamate，Glu)及其受體是主要的突觸傳遞承擔者[5]，同時，海馬LTP也受幾種腦干上行神經遞質系統的調節，其中包括來自中腦的多巴胺(dopamine，DA)系統[6]。DA是中樞神經系統中重要的單胺類神經遞質，參與調節運動控制、認知、情感、攝食和內分泌等多種生理功能，腦內DA還在恐怖記憶等多種記憶形成過程中也起著重要的調節作用[7-8]。DA通過其膜受體發揮作用，目前已分離出的DA受體有5種，即D1～D5受體。研究[6]顯示：海馬DG區有DA能神經元的分布和D1受體的表達，而且DG區的D1受體可調節顆粒細胞的突觸可塑性，但是海馬DG區的DA及其D1受體在大鼠主動回避學習中的作用少有報道。因此，本實驗在大鼠主動回避條件反射的建立以及消退過程中，觀察大鼠海馬DG區細胞外液中DA水平變化，并結合向DG區微量注射D1受體阻斷劑，觀察DA水平對主動回避學習記憶中DG區Glu釋放和突觸傳遞效應的影響，進一步探討海馬DG區DA及其D1受體在大鼠主動回避學習中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 選擇處于成年階段的SD雄性大鼠24只，體質量(200±20)g。實驗所選用的大鼠由延邊大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK (吉) 2017-0003。水合氯醛(天津市大茂供應站)，鄰苯二甲醛、SCH-23390(D1受體阻斷劑)、L-谷氨酸和DA(美國Sigma公司)。8R-6型腦立體定位儀(日本成茂公司)，HTEC-300型生物活性物質微量分析系統和EFC-82型自動樣本收集器(日本Eicom公司)，交流放大器(英國Neurolog公司)，Micro3型信號轉化器(英國CED公司)，穿梭箱(上海移數科技有限公司)。

1.2 實驗動物分組和處理 將大鼠隨機分為非訓練組、訓練組、對照組和SCH組，每組6只。非訓練組大鼠只放入穿梭箱內不進行訓練，訓練組大鼠每天在固定時間段進行穿梭箱訓練，每天訓練結束后檢測大鼠海馬DG區細胞外液中DA水平。對照組和SCH組大鼠每天進行穿梭箱訓練前，分別向2組大鼠海馬DG區注射1 μL生理鹽水或D1受體阻斷劑SCH-23390，觀察大鼠的主動回避反應率、DG區Glu水平和場興奮性突觸后電位(fEPSP)幅值的變化。

1.3 大鼠海馬定位和透析探針的植入 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg·kg-1)進行麻醉，待大鼠深度麻醉后取腹臥位固定于定位儀上，常規消毒后，切開頭皮，根據Paxinos和Watson圖譜，將微量透析探針的外套管垂直地插入大鼠右側海馬DG區上方1 mm處，定位坐標為前囟后(AP)3.2 mm、中縫線右旁開(R)1.6 mm、硬腦膜下深度(H)2.5 mm。因為對照組和SCH組大鼠除了行為學訓練和微量透析以外還需測定突觸可塑性指標—fEPSP幅值，因此埋植微量透析探針外套管的同時，在相同部位插入記錄電極，并在同側穿通纖維(perforant path，PP)處插入刺激電極。記錄電極的定位坐標為AP 3.2 mm、R 2.0 mm、 H 3.5 mm，刺激電極定位坐標為 AP 6.9 mm、R 5.0 mm、H 4.5～5.0 mm。外套管和2種電極采用牙托粉固定，隔天經外套管將微量透析探針插入海馬DG區并采用蠟封固。微量透析探針前端為1 mm長的半透膜(內徑0.20 mm，外徑0.22 mm，日本Eicom公司)，側面粘合微量注射用細管。

1.4 大鼠主動回避反應率的測定 采用穿梭箱對大鼠進行主動回避條件反射實驗，包括條件反射建立和實驗性消退兩個部分。將大鼠放入穿梭箱后自由活動2 min使之適應實驗環境，然后開始訓練，訓練時先給予聲音刺激10 s，再給予電刺激15 s，間隔20 s后，重復上述操作，40次為一輪完整的訓練。達到條件反射建立標準之后進行實驗性消退實驗，此時只給予聲音刺激不給予電刺激。規定只有聲音刺激出現時大鼠逃到對側安全區而躲避了電刺激為1次主動回避反應，主動回避率達到65% 以上為條件反射建立標準，回降到35% 以下為條件反射消退標準。整個訓練周期為1周。

1.5 DG區微量透析樣本采集和微量注射 非訓練組和訓練組大鼠在每天的穿梭箱實驗結束后，其微量透析探針連接微量泵，以1.5 μL·min-1的速度向大鼠海馬DG區灌流改良林格爾液，30 min后采用自動樣本收集器收集DG區細胞外液的微量透析樣本，每管收集10 min，每次收集3個管。對照組和SCH組大鼠在每天進行穿梭箱訓練之前，經微量注射用細管向海馬DG區注射1 μL相應藥物，微量注射速度為0.5 μL·min-1，注射藥物包括生理鹽水(對照組)或SCH-23390(SCH組，1 g·L-1)，注入時程為2 min，滯留1 min后將細管與探針分離，給藥結束后30 min開始進行穿梭箱訓練，訓練結束后收集大鼠DG區細胞外液的微量透析樣本，收集方法與訓練組相同。

1.6 大鼠DG區細胞外液中DA和Glu水平檢測[2]DA水平檢測：將12 μL微量透析樣本注入到生物活性物質微量分析系統中，樣本以0.23 mL·min-1的速度流經系統中的高效液相色譜分離柱和電化學檢測器，檢測大鼠DG區細胞外液中DA水平(單位：μg·L-1)。Glu水平檢測：將12 μL微量透析樣本與3 μL、 4 mmol·L-1鄰苯二甲醛溶液混合均勻，常溫下反應2.5 min后抽取10 μL反應液注入到生物活性物質微量分析系統中，經高效液相色譜分離柱和電化學檢測器測定各樣本中Glu水平(單位：mmol·L-1)。主動回避學習過程中大鼠訓練前各自的基礎DG區DA及Glu水平定義為100%，計算大鼠每天訓練后DG區DA和Glu水平(以百分率表示)。

1.7 大鼠海馬DG區fEPSP幅值的測定[9]大鼠海馬DG區突觸傳遞效應用fEPSP幅值表示，fEPSP幅值增加提示LTP形成。測定方法：通過靈活的刺激隔離器發出單個方波脈沖電刺激(0.1 ms/phase，強度為引起最大fEPSP效應的刺激強度的1/3，間隔30 s)作用到PP，誘發出的反應由交流放大器進行過濾(0.5～2.0 kHz)和放大，將電信號數字化，采用Spick2軟件記錄15個連續的波痕后進行統計學分析。以主動回避訓練前fEPSP幅值的基礎水平為100%，計算大鼠每天訓練后的fEPSP幅值(以百分率表示)。

2 結 果

2.1 主動回避學習中大鼠海馬DG區DA水平 訓練組和非訓練組大鼠海馬DG區細胞外液微量透析樣本中DA基礎水平分別為(0.46±0.08)和(0.41±0.01)μg·L-1，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。在主動回避反應訓練中，訓練組大鼠主動回避反應率隨訓練天數的增加而升高，在訓練第5天達到條件反射的建立標準(68.05 %±2.02 %)，隨后進行實驗性消退，在訓練第7天達到消退標準(28.53 % ± 3.53 %)。訓練組大鼠DG區細胞外液中DA水平隨條件反射的建立逐漸升高，訓練第5天時達到最大值，高于第1天時的DA水平(P<0.05)，并隨著消退實驗回降到訓練前水平。非訓練組大鼠第2～7天海馬DG區DA水平與第1天比較差異無統計學意義(P>0.05)。在穿梭箱訓練第3～5天，訓練組大鼠DG區DA水平明顯高于非訓練組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠海馬DG區DA水平

Group DA level (t/d) 1 2 3 4 5 6 7 Non-training 103.33±6.25 105.08±5.78 104.09±8.69 108.80±9.56 100.93±5.98 99.50±6.43 99.36±4.37 Training 102.14±16.20 140.13±21.67 489.24±91.67*△508.33±92.50*△547.58±60.88*△235.83±53.67 90.13±12.06

*P<0.05vsnon-training group；△P<0.05vs1 d.

2.2 主動回避學習過程中大鼠主動回避反應率 在主動回避反應訓練中，對照組大鼠主動回避反應率隨著訓練天數的增加而升高，在訓練第5天達到條件反射的建立標準；隨后進行消退實驗，在第7天達到消退標準。SCH組大鼠在主動回避反應訓練過程中主動回避反應率有升高的趨勢，但直到訓練周期(共7 d)結束亦未能達到條件反射建立標準，提示阻斷DG區D1受體可明顯抑制主動回避學習過程。見表2。

表2 2組大鼠主動回避反應率

Group Rate of active avoidance (t/d) 1 2 3 4 5 6 7 Control 18.56±0.63 33.75±0.63 38.75±1.25 42.53±0.54 66.01±0.93 38.75±1.24 25.42±2.52 SCH 13.75±0.78 21.25±1.88 22.50±1.89 21.25±0.82 30.42±3.33 16.28±0.67 16.19±1.79

2.3 大鼠DG區Glu水平 在主動回避條件反射建立階段，對照組大鼠DG區Glu水平隨著訓練天數的增加逐漸升高，第4和5天大鼠DG區Glu水平明顯高于第1天(P<0.05)；在隨后的消退實驗過程中Glu水平逐漸回降到訓練前水平。SCH組大鼠海馬DG區Glu水平在主動回避訓練期間變化不明顯，與對照組比較，在訓練第5天SCH組大鼠DG區Glu水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 2組大鼠海馬DG區Glu水平

Group Glu level (t/d) 1 2 3 4 5 6 7 Control 121.90±11.54 140.58±16.82 170.95±21.03 230.42±28.26△ 217.60±30.93△ 122.58±30.56 99.54±25.10 SCH 140.21±21.21 106.52±15.53 155.20±41.67 150.34±46.52 86.85±21.54*70.51±20.75 68.88±12.23

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vs1 d.

2.4 大鼠DG區fEPSP幅值 在主動回避反應訓練過程中，對照組大鼠DG區fEPSP幅值在條件反射建立階段隨著訓練天數的增加逐漸變大，第5天達最大值，且高于第1天(P<0.05)，并在隨后的消退實驗過程中逐漸降低。SCH組大鼠海馬DG區fEPSP幅值在主動回避訓練期間未出現明顯變化,與第1天比較差異無統計學意義(P>0.05);而且在訓練第3、5和6天，SCH組大鼠海馬DG區fEPSP幅值明顯低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組大鼠海馬DG區fEPSP幅值

Group fEPSP amplitude (t/d) 1 2 3 4 5 6 7 Control 85.05±10.57 73.64±9.00 107.57±14.51 111.79±17.59 157.31±21.14△105.50±14.43 102.54±22.88 SCH 76.64±19.80 74.39±20.17 54.35±14.03*72.54±14.91 43.36±18.33*60.46±15.34* 60.58±11.99

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vs1 d.

3 討 論

學習形成與記憶獲得的過程主要發生在海馬結構內[10]，海馬結構在細胞水平上分為CA1、CA2、CA3和DG區，其中DG區主要負責對新信息進行處理和編碼[11]。DA是重要的中樞神經遞質，參與運動、記憶、注意和獎賞等多種腦功能的調節。DA在腦內的神經傳遞依賴于兩大類G蛋白偶聯受體，即D1(D1和D5)和D2(D2～D4)家族受體，其對于腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)的作用是相反的。海馬接收來自于黑質(substantia nigra，SN)和腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)等處多巴胺能神經元的傳入，研究[12-13]顯示：活化VTA使得DA在海馬內釋放，對大鼠被動回避學習和海馬突觸可塑性起重要的調節作用；同時，如果VTA失活就會損傷LTP的維持[14]。作為突觸傳遞效應的活性依賴性調節方式，LTP是中樞神經系統內突觸可塑性的典型表現，也是海馬學習記憶功能的重要生理學機制之一[3-4]。研究[15-16]顯示：海馬LTP在條件反射建立過程中出現，并在條件反射消退過程中消失，且其最高水平和完全消失發生在條件反射相關行為時，提示該類型LTP與學習有關聯，即LD-LTP。雖然不少證據[13,17]表明：海馬CA1區DA及其D1受體參與調節空間學習記憶和被動回避反應等多種學習記憶過程，且DG區觀察到了D1受體的表達[18]，但大鼠DG區DA及其D1受體是否參與主動回避學習目前尚不清楚。本實驗中大鼠海馬DG區DA水平和fEPSP幅值隨著主動回避條件反射的建立逐漸增加，其后隨條件反射消退而回降，提示海馬DG區DA可能參與調節主動回避學習過程中的LD-LTP。

研究[19]顯示：海馬區的LTP(包括LD-LTP)的形成和維持由Glu及其促離子型受體所介導，而后者主要包括N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole-propionic acid，AMPA)受體。本課題組先前的研究[2,15]顯示：海馬DG內的Glu參與大鼠主動回避學習及相關LTP的產生過程。研究[20]顯示：采用D1受體激動劑處理離體海馬可增強NMDA和AMPA受體的磷酸化作用，進而使其介導的EPSP增強，而且在海馬CA1區LTP的誘發需要D1受體與NMDA受體的共同激活[21]。 Kalivas等[22]發現：DA可以調節興奮性氨基酸，即Glu的分泌，提示DG區內D1受體可能通過影響Glu的分泌來促進主動回避學習及其相關LTP的形成。阻斷大鼠DG區D1受體可明顯抑制主動回避學習以及該過程中Glu的釋放和LD-LTP的產生[23]。本研究結果表明：大鼠DG區中的DA通過激活D1受體促進大鼠主動回避學習過程，并主要通過增加興奮性氨基酸的興奮傳遞來完成這一過程，但是Glu水平升高后是否通過NMDA受體和AMPA受體起作用，其受體激活的下游機制尚有待于進一步研究。