不同粘結條件下健康成人牙本質中MMP-2和MMP-9表達水平及其意義

王春萌，李 賀，張志鷹，李男男，趙 聰，洪麗華，張志民

(1．吉林大學口腔醫院牙體牙髓科，吉林 長春130021；2.吉林大學口腔醫院口腔預防科，吉林 長春130021)

在牙體疾病的治療中，將粘結樹脂在處理過的牙體組織上粘結修復成形或者將修復體粘結固定是最常見的治療方法之一。然而，由于牙本質自身結構和口腔環境的復雜性，如牙體本身所承擔的應力、口腔內溫度、口腔內菌群的影響以及酶的作用等，隨著修復時間的延長，牙本質-樹脂粘結界面所形成的混合層被破壞，導致牙本質粘結失敗[1-2]。研究[3]表明：在牙本質的有機質形成過程中，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)起重要的調節作用。在人牙本質基質中主要包含MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-20等,其中MMP-2和MMP-9在人健康牙本質以及伴有齲壞的牙本質中以不同形式廣泛存在且水平較高[3-6]，研究[7]表明：在自酸蝕粘結以及全酸蝕粘結中，MMP-2和MMP-9可能參與了粘結界面混合層中裸露膠原的降解，從而減弱了粘結效果。因而使用MMPs抑制劑保護混合層的完整性和維持粘結強度成為牙本質粘結研究的熱點[8-9]。

氯己定(chlorhexidine，CHX)是目前研究最為廣泛的MMPs抑制劑[10]，CHX能通過螯合作用結合鈣、鋅離子，抑制MMPs催化區域的活性，避免其降解膠原[11]。四環素類作為一種有效的MMPs抑制劑，不僅具有針對鋅離子的螯合作用，還能降低MMP mRNA的表達[12]。本課題組前期實驗[13]結果也表明:CHX和四環素半合成類似物米諾環素(minocycline，MI)對于牙本質粘結的預處理均能夠使牙本質粘結界面形成更加均勻、致密、穩定的混合層，改善牙本質粘結的耐久性。目前國內外關于牙本質粘結中MMPs抑制劑的研究[14-16]大多局限于牙本質的形態表現和力學方面，尚無研究應用抑制劑后牙本質粘結中MMP-2和MMP-9的活性變化。本實驗利用明膠酶譜法，探討CHX和MI抑制劑作用后以及不同粘結方法下MMPs在牙本質中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

收集本院新鮮拔除的成人健康第三磨牙20顆，無齲壞，無牙體缺損，無充填物，無牙周病，無釉質發育不良，根尖孔閉合完全。拔除后以生理鹽水沖洗，-80℃保存并在1個月內使用。所有實驗用牙齒均經患者知情同意并獲吉林大學口腔醫學會倫理委員會批準。MMPs抑制劑CHX購自武漢遠程共創科技有限公司，MI購自美國Sigma公司。自酸蝕粘結劑：3M通用粘結劑即Single Bond Universal(美國3M公司)；全酸蝕粘結系統：35%磷酸凝膠(美國SCI-PHARM公司)+ Adpter Single Bond 2(美國3M公司)。

1.2 實驗分組

1.2.1 自酸蝕粘結劑實驗分組 以未處理的礦化牙本質粉作為陰性對照組，以10%磷酸溶液處理的牙本質粉為作為陽性對照組，以僅使用Single Bond Universal處理的牙本質粉作為空白對照組；分別加入CHX和MI作為CHX預處理組和MI預處理組；在Single Bond Universal粘結牙本質后使用10%次氯酸鈉老化處理，作為空白老化對照組，并在此基礎上加入CHX和MI作為CHX預處理老化組和MI預處理老化組。

1.2.2 全酸蝕粘結劑實驗分組 以未處理的礦化牙本質粉作為陰性對照組，以10%磷酸溶液和35%磷酸凝膠處理的脫礦牙本質粉分別作為陽性對照1組和陽性對照2組，以僅使用35%磷酸凝膠+Adper Single Bond 2處理的牙本質粉作為空白對照組；牙本質粉分別加入CHX及MI作為CHX預處理組和MI預處理組；牙本質粉進行全酸蝕粘結劑粘結后采用10%次氯酸鈉老化處理，作為空白老化對照組，并在此基礎上加入CHX和MI作為CHX預處理老化組和MI預處理老化組。

1.3 試劑配制

蛋白萃取液：50 mmol·L-1Tris-HCL(pH 6)，5 mmol·L-1CaCl2，100 mmol·L-1NaCl, 0.1% Triton X-100，0.1%離子去除劑P-40，0.1 mmol·L-1、0.02% NaN3。洗脫液：2.5% Triton X-100，50 mmol·L-1Tris -HCl，5 mmol·L-1CaCl2，1 μmol·L-1ZnCl2。漂洗液：50 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1CaCl2，1 μmol·L-1ZnCl2。孵育液：0.02%Brij-35，50 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1CaCl2，1 μmol·L-1ZnCl2。制膠：與普通的聚丙烯酰胺凝膠的制膠過程相同,只在分離膠中加入1%明膠,使明膠的終濃度為0.1%。染色液：0.25%考馬斯亮蘭R-250，30%甲醇，10%乙酸。脫色液A、B、C：甲醇濃度分別為30%、20%和10 %,乙酸濃度分別為10 %、10 %和5%。

1.4 明膠-聚丙烯酰胺凝膠酶譜法測定不同粘結條件下人健康牙本質中MMP-2和MMP-9表達水平 參照Mazzoni等[3]的方法，首先采用慢速切割機在流水冷卻條件下去除牙釉質、牙骨質和牙髓，余留牙本質塊。研缽中液氮研磨成粉末。丙酮沖洗5次，離心，5次蒸餾水沖洗，采用配置好的蛋白萃取液萃取24 h。以20%TCA等體積加入，4℃冰浴2 h進行蛋白沉淀。然后-20℃下采用預冷的丙酮洗滌沉淀，加入丙酮后，10 000 g×5 min,洗滌2次。將獲得的蛋白樣本采用上樣液溶解，2×loading buffer 混合，在已經制好的以明膠為底物的凝膠上上樣后進行電泳，樣本跑至分離膠前為80 V，至分離膠后改為100 V。電泳結束后,將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫、漂洗,然后將凝膠置于孵育液中37℃恒溫搖床振蕩20 h。孵育結束后經考馬斯亮藍染色液染色3 h,脫色液A、B和C 分別脫色0.5、1.0和2.0 h后，顯示出MMP-2 和MMP-9位于藍色背景上的透亮帶，采用凝膠圖像分析系統分析讀取條帶面積、寬度和灰度值。陰性對照組條帶相對灰度值定義為1，計算各組牙本質粉中MMP-2和MMP-9表達水平。MMP-2表達水平= MMP-2條帶灰度值/對照組條帶的灰度值， MMP-9表達水平= MMP-9條帶灰度值/對照組條帶的灰度值。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 自酸蝕粘結劑粘結后各組牙本質中MMP-2和MMP-9表達水平

與空白對照組比較，CHX預處理組牙本質中MMP-2和MMP-9表達水平降低(P<0.05)，MI預處理組牙本質粉中MMP-2和MMP-9表達水平降低(P<0.05)。與空白對照組比較，空白老化對照組牙本質中MMP-2表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，MMP-9表達水平升高(P<0.05)。與空白老化對照組比較，CHX預處理老化組牙本質中MMP-2和MMP-9表達水平降低(P<0.05)；MI預處理老化組牙本質中MMP-2和MMP-9的表達水平降低(P<0.05)。見圖1和表1。

2.2 全酸蝕粘結劑粘結后各組牙本質中MMP-2表達水平

牙本質粉進行全酸蝕粘結(35%磷酸凝膠+Adpter Single Bond 2)處理后，凝膠成像系統成像，可見該陰性對照組中有2種MMP-2形式的表達(即proMMP-2和MMP-2)，MMP-9位置處可在深色背景上見微弱的透明條帶，但由于激活數量較少，ImageJ 2×軟件未能測量其灰度值。與空白對照組比較，CHX預處理組牙本質中MMP-2表達水平降低(P<0.05),Pro MMP-2表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組比較，MI預處理組牙本質中MMP-2表達水平降低(P<0.05), Pro MMP-2表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與空白老化對照組比較，CHX預處理老化組牙本質粉中MMP-2表達水平降低(P<0.05)，MI預處理老化組牙本質粉中MMP-2表達水平也降低(P<0.05)。見圖2和表2。

Lane 1：Positive control group; Lane 2: Blank control group; Lane 3: Negative control group: Lane 4: CHX group; Lane 5:MI group; Lane 6: Aging blank group; Lane 7: CHX aging group; Lane 8: MI aging group.

圖1 自酸蝕粘結劑粘結后各組牙本質中MMP-2和MMP-9表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of MMP-2 and MMP-9 in dentin in various groups after bonding of self-etching adhesives

表1 自酸蝕粘結劑粘結后各組牙本質中MMP-2 和MMP-9表達水平

GroupMMP-2MMP-9Negative control1.00±0.001.00±0.00Positive control3.05±0.03*6.57±0.80*Blank control2.61±0.11*4.22±0.01*CHX1.23±0.19△2.25±0.45△MI1.19±0.03△2.44±0.04△Aging blank control2.36±0.135.76±0.03△CHX aging 1.37±0.03#3.60±0.14#MI aging 0.90±0.03#2.42±0.04#

*P<0.05 compared with negative control group;△P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with aging blank control group.

3 討 論

牙本質中含有約20%有機基質，其中90%由Ⅰ型膠原纖維組成，而這種膠原纖維是各種牙本質源性MMPs的作用底物。在牙本質粘結中，混合層的破壞很大程度上是因為粘結界面的膠原在長期老化過程中被活化的MMPs降解[17]。MMP-2和 MMP-9又稱明膠酶,是MMPs作為細胞外基質降解酶系中最重要的一種,二者在健康牙本質、伴有齲壞的牙本質以及進行粘結修復后的牙本質中的表達情況往往可以顯示出牙本質的破壞與修復情況。采用以明膠為底物的聚丙烯酰胺凝脈電泳為基礎的酶譜法是一種敏感性高且實用的檢測牙本質粘結中MMP-2和MMP-9表達水平及其抑制劑功效的技術[18]。

Lane 1:Negative control group; Lane 2:Positive control 1 group; Lane 3:Positive control 2 group; Lane 4:Blank control group; Lane 5:CHX group; Lane 6:MI group; Lane 7: Aging blank group; Lane 8:CHX aging group; Lane 9:MI aging group.

圖2 全酸蝕粘結劑粘結后各組牙本質中MMP-2和MMP-9表達電泳圖

Fig.2 Electrophoretogram of expressions of MMP-2 and MMP-9 in dentin in various groups after bonding of total-etching adhesives

表2 全酸蝕粘結劑粘結后各組牙本質中Pro MMP-2和MMP-2表達水平

GroupPro MMP-2MMP-2Negative control1.00±0.001.00±0.00Positive control 11.19±0.032.17±0.28*Positive control 21.39±0.04*2.31±0.30*Blank control1.79±0.22*2.89±0.23*CHX1.45±0.021.90±0.11△MI1.23±0.121.75±0.10△Aging blank control1.48±0.052.25±0.32CHX aging1.33±0.012.08±0.29#MI aging1.48±0.141.77±0.16#

*P<0.05 compared with negative control group;△P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with aging blank group.

在粘結過程中，未被樹脂聚合物完全包裹的膠原纖維易隨著時間的推移被酶水解，而樹脂聚合物的降解導致更多膠原的暴露。不再受保護的膠原纖維在混合層的基礎上被蛋白酶破壞，導致混合層失去其錨定功能，降低粘結強度[19]。以上實驗證實了Single Bond Universal自酸蝕粘結劑及Adper Single Bond 2全酸蝕粘接劑在使用過程中均能夠不同程度地激活牙本質中的MMP-2和MMP-9，從而降低粘結強度[20],且在自酸蝕粘結過程中，MMP-2與MMP-9表達水平明顯升高，在全酸蝕粘結過程中，MMP-2表達水平明顯升高。而這可能與MMP-2與MMP-9的作用方式有關，MMP-2的主要作用方式是降解結締組織中的膠原，將膠原纖維分解為肽碎片，而MMP-9不能直接溶解Ⅰ型膠原，而是通過分解低相對分子質量肽鍵等Ⅰ型膠原水解后的產物使酶解作用繼續進行[21]。在全酸蝕粘結過程中，酸蝕后進行了沖洗過程，此時相當一部分Ⅰ型膠原水解產物可能被除掉，并由此減弱了MMP-9的作用。

研究[22]顯示:牙本質的粘結強度在1年的儲存時間內會下降36%～70%，因此抑制酶活性是延長樹脂牙本質粘結強度的關鍵。本實驗證明MMPs抑制劑CHX和MI能夠在一定程度上減少MMP-2和MMP-9的激活,這與已有研究[23]結果相符。且在進行老化處理后，CHX與MI可降低自酸蝕粘結后牙本質中MMP-2與MMP-9表達水平，說明CHX和MI預處理能夠對自酸蝕粘結起到維持其耐久性的作用。利用外源性抑制劑來減少粘結過程中MMPs的活化對于混合層的穩定性能起一定作用，然而單一抑制劑的抑制作用卻有限，難以真正維持其耐久性，因此在未來的基礎研究和應用中，應逐漸進行多種抑制劑的聯合應用，以發揮對MMPs活性最大程度的抑制作用。

本實驗模擬體外臨床上使用MMPs抑制劑的方式，即作用1 min后用去離子水沖洗去除、再進行自酸蝕粘結的濕粘結過程，結果表明:臨床上應用這種底涂-沖洗的方法能夠減少MMPs的激活量，從而在短期甚至是粘結修復后一段時間內提高粘結性能。但由于全酸蝕粘結時需要在酸蝕后進行大量沖洗，抑制劑的作用是否能夠遠期維持仍值得深入研究，單純的明膠酶譜實驗對于牙本質粘結中MMP-2與MMP-9表達所進行的半定量研究并不能完全精確而有效證明2種粘接劑在使用過程中激活酶的數量以及CHX和MI對其的抑制程度；在研磨過程中，研磨的機械作用可能會造成酶的激活，雖然采用了冷卻研磨方式，但由于研磨時冷卻能力有限，所產生的熱也可能造成牙本質粉中酶的激活[3]。因此，對于不同牙本質粘結方式下MMPs抑制劑MMP-2和MMP-9的作用仍值得深入研究。