沉默WNT4基因?qū)Ψ€(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2基因大鼠腎小管上皮細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

李 里, 宮 亮,吳玉斌

( 1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，遼寧 錦州 121000；2. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧 錦州 121000；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒腎臟風(fēng)濕免疫科，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

配對(duì)盒基因2(paired box gene 2,PAX2)是調(diào)控腎臟發(fā)育的重要調(diào)控因子[1-4]。研究[5]表明:在調(diào)控后腎臟發(fā)育過(guò)程中，間充質(zhì)向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要步驟里WNT4基因發(fā)揮重要作用，PAX2基因通過(guò)激活該基因完成該過(guò)程。如果將PAX2基因敲減可導(dǎo)致細(xì)胞停止分化，因此推測(cè)WNT4是PAX2的作用基因。本課題組前期研究[6]表明：PAX2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，激活了WNT通路，WNT4表達(dá)水平明顯升高，因此認(rèn)為WNT4基因可能是PAX2基因的靶基因。本課題組前期研究[7]表明：PAX2基因轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞后，可以增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力，改變其生物學(xué)活性。PAX2基因是否通過(guò)WNT4基因調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)活性目前尚無(wú)定論。本研究采用RNA沉默技術(shù)，沉默WNT4基因后觀察細(xì)胞生物學(xué)活性的改變，探討PAX2基因是否通過(guò)WNT4基因調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2基因的細(xì)胞(本課題組前期構(gòu)建)。WNT4 siRNA(本課題組前期已構(gòu)建)，WNT4兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Zymed公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Transwell 細(xì)胞小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó) Beekman Coulter公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

1.2 WNT4 siRNA的設(shè)計(jì)和合成 本課題組前期已通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究確定3對(duì)siRNA，其中最佳為WNT4 siRNA：sense，5′-CACGCACUAAAGGAGAAGUTT- 3′;anti-sense,5′-ACUUCUCCUUUAGCGCGUGTT- 3′。最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為72 h[6]。

1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)和分組 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2的大鼠腎小管上皮細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下，于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。細(xì)胞分為穩(wěn)轉(zhuǎn)組(采用WNT4 siRNA處理)和對(duì)照組(無(wú)特殊處理)。將穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞分為穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組(不應(yīng)用WNT siRNA沉默)和沉默72 h組(應(yīng)用WNT siRNA沉默72 h)。

1.4 WNT4 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠腎小管上皮細(xì)胞 取4 μg WNT4 siRNA 加入無(wú)血清高糖DMEM中(每孔總體積250 μL)；5 μL 脂質(zhì)體2000加入245 μL 高糖無(wú)血清DMEM(每孔總體積250 μL)。將2種溶液混合，加入培養(yǎng)板，輕輕混勻。吸棄轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h收集細(xì)胞(沉默72 h組)。

1.5 Western blotting法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)組和對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中PAX2和WNT4 蛋白相對(duì)表達(dá)量 配制5%SDS-PAGE濃縮膠，采用 1 mL加樣器將混合液加入玻璃板夾心的凝固分離膠上面，待膠凝固后置于-4℃保存。電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液后，80 V電壓，直至溟酚藍(lán)指示劑遷移至分離膠底部，關(guān)閉電源。戴手套取出電泳凝膠，浸泡于電泳緩沖液中，切下目的凝膠條帶。將結(jié)合了蛋白的PVDF膜采用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷醋/四氮唑藍(lán)(BCIP/NBT/uffer，1∶1∶50)試劑盒顯色。測(cè)試目的條帶的吸光度(A)值，將其與同一樣本的β-actinA值的比值進(jìn)行定量分析，該數(shù)值即代表檢測(cè)樣本的蛋白相對(duì)表達(dá)量。PAX2蛋白相對(duì)表達(dá)量=PAX2 蛋白A值/β-actin A值。WNT4 蛋白相對(duì)表達(dá)量=WNT4 蛋白A值/β-actin A值。

1.6 Real time PCR法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量 將各組細(xì)胞中加入1 mL RZ裂解液，充分混勻，充分振蕩，緩慢加入0.5倍體積無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置2 min，4℃、12 000 r·min-1離心2 min，所得即為樣本總RNA。在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定待測(cè)RNA樣品A值。反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA：加入1 μL(200 U)TIANScript M-MLV，采用移液器輕輕混勻。42℃溫浴50 min。95℃ 加熱5 min終止反應(yīng)。按照試劑盒要求，配制20 μL PCR反應(yīng)液(冰上操作)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95℃、10 min，95℃、10 s，60℃、20 s,35個(gè)循環(huán)；72℃、30 s，4℃、5 min，4個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件(由機(jī)器自行設(shè)定)：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。采用相對(duì)定量方法 RQ=2-△△Ct計(jì)算WNT4基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)樣品Ct-內(nèi)參基因Ct)-(基準(zhǔn)樣品Ct-內(nèi)參基因Ct)。

表1 Real time PCR法檢測(cè) WNT4 和 β-actin 引物序列

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞遷移率 采用pipette tip 造成細(xì)胞劃痕，將前1天采用0.25%胰蛋白酶消化的腎小管上皮細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，待細(xì)胞聚集達(dá)80%～90%，采用pipette tip造成細(xì)胞劃痕后，加入培養(yǎng)基于細(xì)胞表面洗滌2次，之后于培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，10和18 h后顯微鏡下照相，觀察愈合情況，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-10 h或18 h劃痕寬度)∕0 h劃痕寬度×100%。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù) 將50 μL Matrigel (1 g·L-1) 均勻鋪在Transwell的8 μm孔徑聚碳酸酷微孔濾膜上。將600 μL含胎牛血清的NIH3T3細(xì)胞的上清中加入Transwell下室各孔。將不含血清的200 μL穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組細(xì)胞懸液加入Transwell上室，培養(yǎng)48 h。將Transwell小室取出。固定染色后，在200倍倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取16個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并照相。以每個(gè)高倍鏡下穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)組和對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中PAX2和WNT4蛋白相對(duì)表達(dá)量 穩(wěn)轉(zhuǎn)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中PAX2 蛋白相對(duì)表達(dá)量為 1.12±0.14 ，對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中PAX2 蛋白相對(duì)表達(dá)量為 0.87±0.05 ，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=376.6，P<0.05 )。見(jiàn)圖1。

穩(wěn)轉(zhuǎn)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中WNT4 蛋白相對(duì)表達(dá)量為 1.03±0.15，對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中WNT4 蛋白相對(duì)表達(dá)量為 0.85±0.11，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=368.7，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 Western blotting法檢測(cè)2組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中PAX2蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of PAX2 protein in renal tubular epithelial cells of rats in two groups detected by Western blotting method

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量 Real time PCR結(jié)果表明：沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.47±0.02，穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中WNT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.87±0.05，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=264.5，P<0.05 )。見(jiàn)圖3。

圖2 Western blotting法檢測(cè)2組腎小管上皮細(xì)胞中WNT4蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of WNT4 protein in renal tubular epithelial cells of rats in two groups detected by Western blotting method

2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞遷移率 沉默10 h后穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞遷移率分別為(43.12±7.13)%和(35.31±6.54) %，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。沉默18 h后，穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組細(xì)胞遷移率分別為( 83.72±7.12)%和(40.31±7.14) %，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=497.5，P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù) 穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，2組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為 (46.33±3.63)和(38.00±8.14)個(gè)；與穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組比較，沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=291.6，P<0.05)。見(jiàn)圖5(插頁(yè)四)。

3 討 論

本研究利用本課題組前期構(gòu)建的PAX2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)染鑒定及WMT4蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：PAX2和WNT4蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明PAX2基因轉(zhuǎn)染后激活了WNT4基因的表達(dá)，這與本課題組前期研究[6]結(jié)果一致。PAX2 可激活WNT4 基因，提示W(wǎng)NT4基因可能是PAX2基因的靶基因[8-11]。

本課題組前期研究[7]已經(jīng)證實(shí)：PAX2基因可以提高細(xì)胞的遷移和侵襲能力。目前研究[12-13]顯示：PAX2基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)LSD1及EPHA2調(diào)控細(xì)胞侵襲程度。研究[14]顯示：胎鼠中 WNT4 表達(dá)水平較高，在正常成熟大鼠的腎臟組織中WNT4處于失活狀態(tài)。研究者[15-16]在高表達(dá)PAX2基因的UUO大鼠腎臟組織中發(fā)現(xiàn)WNT4基因表達(dá)水平明顯升高，將WNT阻斷后，腎臟纖維化程度減輕。研究者[16-17]觀察到WNT4基因可促進(jìn)腎間質(zhì)細(xì)胞合成 α-SMA 和Ⅰ型膠原。

A，C： WNT4 melting curve;B，D：β-actin amplification curve；A，C： Silening 72 h group;B,D：Stably transfected control group.

Fig.3 Relative expression amounts of WNT4 mRNA in renal tubular epithelial cells of rats in stably transfected control and silence 72 h groups detected by Real time PCR method

PAX2是否通過(guò)WNT4來(lái)調(diào)控細(xì)胞的遷移和侵襲能力目前尚無(wú)報(bào)道。本課題組將WNT4基因沉默，觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，結(jié)果表明：劃痕18 h后，沉默72 h組細(xì)胞遷移率較穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組明顯降低，沉默72 h組穿膜細(xì)胞數(shù)較穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組減少，提示沉默WNT4后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。本研究結(jié)果與Chen 等[18]的研究結(jié)果相似，在胸腺瘤的研究中發(fā)現(xiàn)WNT4基因通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞侵襲程度而發(fā)揮重要作用。在氧化損傷過(guò)程中，WNT4參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移侵襲。本課題組沉默了PAX2激活的WNT4基因后，細(xì)胞侵襲和遷移能力減弱，說(shuō)明PAX2可能通過(guò)調(diào)控WNT4基因來(lái)改變腎小管上皮細(xì)胞生物學(xué)活性[19-20]。

A,B：0 h；C, D：10 h；E, F:18 h； A,C,E:Stably transfected control group；B,D,F: Silencing 72 h group.

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組和沉默72 h組大鼠腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞遷移情況(×100)

Fig.4 Migration of renal tubular epithelial cells of rats in stably transfected control and silencing 72 h groups at different time points

綜上所述， PAX2基因轉(zhuǎn)染正常腎小管上皮細(xì)胞后使得細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，并激活了WNT4表達(dá)，沉默WNT4后出現(xiàn)了細(xì)胞遷移和侵襲能力較沉默前減弱，因此推測(cè)WNT4基因可能是PAX2調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)活性的主要基因。