芬戈莫德對神經干細胞和星形膠質細胞增殖及遷移的影響及其對小鼠脊髓損傷的保護機制

劉林娜，陳婕妤，呂方怡，花扣珍，蔡大敏，銀國利，王俊娟

(1.溫州醫科大學附屬第二醫院檢驗醫學科，浙江 溫州 325000；2.杭州醫學院基礎醫學與法醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，浙江 杭州310014)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是骨科臨床較常見的疾病[1]，隨著現代社會交通、建筑事業的快速發展，SCI患者日漸增多，目前美國每100萬人口中有906例SCI患者[2]。SCI容易致殘，使患者喪失部分或者全部勞動力，給社會和家庭造成嚴重負擔。由于神經系統內源性再生能力極弱[3]，目前除了SCI 8 h內給予大劑量甲基強的松龍對于治療SCI有一定治療效果外，并無其他更有效的治療辦法。因此針對SCI繼發性損傷的機制探討及探索新的治療方式成為當前研究的熱點。SCI后會發生復雜的病理變化，如局部組織缺血、水腫引起神經元凋亡和壞死，壞死的神經元軸突斷裂并發生脫髓鞘反應，同時在局部形成脊髓空洞[4-5]。局部炎癥反應可以刺激星形膠質細胞異?；罨?、聚集和增生形成膠質瘢痕，形成的膠質瘢痕一方面構成了神經元再生修復的物理屏障，一方面通過分泌阻礙再生的炎癥因子構成了神經元再生的化學屏障[6-7]。因此促進神經元再生與修復，減弱脫髓鞘反應和局部的膠質瘢痕形成可以有效地促進SCI的修復。

芬戈莫德(fingolimod，FTY720)是一種鞘氨醇-1-磷酸受體調節劑，具有良好的免疫調節特性，是第一個被批準用于治療復發緩解型多發性硬化癥的口服藥物，其神經保護作用已經得到認可[6]。研究[7]顯示：FTY720可以有效抑制T細胞遷移進入中樞神經系統，減少病灶處的局部免疫反應起到相應的治療作用。FTY720是一類親脂小分子,可以輕易穿過血腦屏障[8]，在神經元、神經干細胞(neural stem cells ，NSCs)和星形膠質細胞等多種細胞中也有FTY720受體表達[9]。實驗[10-12]證實：對SCI和阿爾茨海默病等非免疫原因引起的中樞神經系統疾病患者給予口服FTY720治療能夠明顯改善疾病的預后，提示FTY720可以通過直接作用于NSCs和星形膠質細胞等起到神經保護作用，但其具體機制尚未見報道。開發一種新型藥物并探討其具體機制對于治療SCI具有重大意義，本研究圍繞FTY720作為治療SCI新型藥物的問題，觀察FTY720對NSCs和星形膠質細胞等增殖及遷移的影響，探討FTY720參與SCI修復的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 25只體質量約為25 g的成年C57BL/6雄鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK(滬)2012-0002，使用許可證號：SVXK(浙)2013-0814。FTY720(美國Cayman Chemical公司)，4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(索萊寶科技有限公司)，Nestin和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrill acidic protein,GFAP)(美國Thermo Fisher公司)，TaKaRa逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。BX41光學顯微鏡及成像系統(日本Olympus公司)，Leitz 1512 石蠟切片機(德國Leitz 公司)。

1.2 細胞的體外分離和分組 取5只出生后24 h內的C57BL/6小鼠，酒精消毒后置入D-Hanks’液，洗滌，取其整條脊柱，去除外層肌肉，將剪刀沿脊柱將椎板打開，暴露整個脊髓，除去脊髓表面結締組織和血管,分離大鼠脊髓組織。 加入1 mL胰酶消化后加入少量含血清的培養基終止消化，離心5 min。將分離得到的細胞分別在裝有NSCs和星形膠質細胞的培養基中培養。將2種細胞分別隨機分成對照組(采用PBS進行處理)和實驗組(采用0.1 μmol·L-1FTY720進行處理)。

1.3 SCI動物模型構建 取20只C57BL/6小鼠，確定小鼠體表T10的標志，暴露椎板，用咬骨鉗和小鑷子咬去T9棘突，打開椎板，暴露一段5 mm長的脊髓。 采用顯微解剖刀對準并避開脊髓后正中動脈，貫穿脊髓，向右側平移至完全橫斷右側脊髓。縫合軟組織及皮膚。術后3 d給予抗生素預防感染常規排尿護理。

1.4 動物分組和給藥方式 將上述已造模小鼠隨機分成對照組和實驗組，每組10只。對照組小鼠口服PBS，實驗組小鼠口服1 mg·kg-1·d-1FTY720，均連續給藥14 d。

1.5 Transwell實驗觀察2組NSCs遷移細胞數 當培養的NSCs長到約90%時，吸走培養基后加入適量無菌PBS洗滌2次。加入胰酶消化后加入少量含血清的培養基終止消化，離心5 min。采用移液槍輕輕吹打培養皿底部細胞，將吹打下的細胞收集至15 mL離心管中，1 300 r·min-1離心5 min。棄去上清后重懸細胞并計數，然后稀釋至5×106mL-1,取0.1 mL細胞懸液，分別加入Transwell上室，在Transwell下室中加入0.6 mL培養基，在培養箱中37℃、5%CO2的環境中遷移12 h。將Transwell小室膜上下的細胞采用1×PBS洗滌3次，每次5 min。采用4%多聚甲醛固定15 min。1×PBS洗滌3次，每次5 min。將小室上層細胞采用醫用棉簽輕輕擦拭，留下小室下層細胞DAPI染色后光學顯微鏡下觀察計數。取對照組和實驗組培養的NSCs或者SCI 4周后的脊髓冰凍切片，采用PBS洗滌3次，每次5 min，4%多聚甲醛溶液固定15 min后，PBS洗去多余固定液。采用0.2%Triton X-100透膜5 min，采用PBS洗滌3次，每次5 min。采用5% BSA室溫封閉30 min，采用1%BSA稀釋一抗Nestin或者GFAP，加入稀釋好的一抗，放在濕盒里孵育，4℃過夜。次日，采用PBS洗滌3次，每次5 min。加入1%BSA稀釋的488二抗(山羊抗鼠)避光孵育1 h后，采用PBS洗滌3次。加入DAPI進行細胞核染色5 min，采用PBS洗滌3次，每次5 min。采用免疫熒光封片劑封片，暗盒保存。取對照組和實驗組星形膠質細胞，以與NSCs同樣方式進行上述實驗操作。在熒光顯微鏡下觀察NSCs遷移細胞數和增殖神經球數以及星形膠質細胞遷移細胞數，體內檢測小鼠SCI震中GFAP熒光強度，以此表示星形膠質細胞數。

1.6 HE染色檢測小鼠SCI空洞面積 造模4周后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，剪開右心耳，經左心室灌入PBS直到小鼠肝臟變白，然后灌入4%多聚甲醛直到小鼠尾巴翹起變硬。經4%多聚甲醛內固定后以10%～30%蔗糖梯度脫水。取損傷中心前后約1 cm長(頭尾各50 mm)脊髓組織進行連續冰凍切片，切片厚約20 μm。將切片放置烘箱過夜烘干。蒸餾水滴洗樣本2 min，將樣本放入蘇木素中染色5 min，采用自來水沖洗。迅速插入鹽酸乙醇,分化1 s后拔出。樣本置于自來水中浸泡15 min，伊紅溶液中30 s。在光學顯微鏡下對HE染色后的脊髓切片進行照相，采用PS軟件直接測量SCI空洞面積。

1.7 Basso Mouse Scale(BMS)評分評估小鼠運動能力的恢復情況 術后1、2、3、4和5周分別以改良標準BMS評分法評估所有小鼠的后肢關節活動度、協調性、腳爪姿態、軀干穩定性及尾巴姿勢等。所有觀察均在上午10：00～12：00進行，每次持續2 min。同時采用數碼攝像機記錄小鼠行為。所有評分均在單盲情況下進行。

2 結 果

2.1 2組小鼠NSCs遷移細胞數 與對照組比較，實驗組NSCs遷移細胞數增多(P<0.05)。DAPI染色結果顯示：實驗組NSCs遷移細胞數增多，即0.1 μmol·L-1FTY720能促進NSCs的遷移。見圖1和2(插頁四)。

*P<0.05 vs control group.

Fig.1 Number of migration cells of NSCs of mice in two groups

2.2 2組小鼠NSCs增殖神經球數 與對照組比較，實驗組NSCs增殖神經球數增多(P<0.05)，形態較飽滿。 見圖3和4(插頁四)。

2.3 2組小鼠星形膠質細胞的遷移細胞數 與對照組比較，實驗組小鼠星形膠質細胞遷移細胞數減少(P<0.05)，細胞形態較癟。見圖5和6(插頁五)。

*P<0.05 vs control group.

Fig.3 Number of proliferative neurospheres of NSCs of mice in two groups

*P<0.05 vs control group.

Fig.5 Number of migration cells of astrocytes of mice in two groups

2.4 2組小鼠SCI震中星形膠質細胞數 與對照組比較，實驗組小鼠SCI震中星形膠質細胞數減少(P<0.05)，細胞形態不完整；對照組小鼠SCI震中星形膠質細胞數較多，細胞形態完整。見圖7和8(插頁五)。

2.5 2組小鼠SCI空洞面積和愈合情況 與對照組比較，FTY720組小鼠SCI空洞面積縮小(P<0.05)。見圖9和10(插頁五)。

2.6 2組小鼠BMS評分 隨著時間的推移，2組小鼠BMS評分均升高，但實驗組小鼠BMS評分升高更明顯。與對照組比較，實驗組小鼠BMS評分明顯升高(P<0.05)。見圖11。

*P<0.05 vs control group.

Fig.7 Fluorescence intensities of GFAP in damaged SCI of mice in two groups

*P<0.05 vs control group.

*P<0.05 vs control group.

Fig.11 Diagram of relationship between BMS scores and time of mice in expriment group and control group after SCI

3 討 論

雖然FTY720對于SCI的保護作用已有報道，但是以往的研究[13]結果顯示：FTY720主要通過抑制T細胞遷移而減少血液中T細胞水平，使其停留在淋巴結中發揮相應的作用。最近有研究[14]顯示:FTY720對重癥聯合免疫缺陷小鼠SCI后的神經保護作用與野生型小鼠無異，引起研究者對于FTY720的再次關注。本研究結果顯示:FTY720可以促進小鼠SCI后的組織學修復和運動功能恢復，該結果與以往的研究結果[14]吻合。

星形膠質細胞在SCI損傷過程中扮演了重要的角色，其可以在損傷處大量聚集，分泌抑制神經再生的因子，構成SCI修復的物理及化學屏障[6-7]。因此，有效抑制星形膠質細胞的增殖活化和遷移至損傷局部可以有效地促進SCI的修復[14]。本研究采用Transwell實驗檢測了FTY720對于星形膠質細胞遷移能力的影響，結果顯示：FTY720在體外可以顯著抑制星形膠質細胞的遷移；熒光染色結果顯示：FTY720可以明顯減少星形膠質細胞在SCI震中的聚集，促進小鼠SCI后運動功能修復。研究[15]顯示:FTY720對于敲除了星形膠質細胞表面受體多發性硬化小鼠治療無效，提示FTY720可能通過作用于星型膠質細胞起到治療多發性硬化的作用，本研究結果在體內和體外再次驗證了FTY720對于星形膠質細胞的作用。

NSCs可以分化為神經元和少突膠質細胞，可加速神經結構的重構，同時改善SCI的局部炎癥，抑制局部炎癥環境毒性作用，促進NSCs在SCI后增殖和遷移至損傷局部以有效地改善SCI后的損傷修復[16-19]。本研究結果顯示:FTY720在體外可以明顯促進NSCs的增殖和遷移，該結果再次從非免疫角度闡明了FTY720對于SCI修復的可能作用機制，為FTY720作為治療SCI藥物的研發提供了理論依據。

本研究結果初步證實：FTY720可以直接作用于NSCs和星形膠質細胞，影響其增殖或者遷移，從而促進SCI的恢復。本研究結果初步闡明了FTY720對于SCI修復的可能作用機制，為FTY720作為治療SCI藥物的研發提供了理論依據。