乙型肝炎病毒相關性腎小球腎炎患兒血清中HBV-cccDNA水平檢測及其臨床意義

雷曉燕，孫永紅，陳星星，高 霞，宋元春，賽依帕，劉 璟，袁 宏

(1．甘肅省人民醫院兒科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學附屬第一醫院傳染病科，甘肅 蘭州 730000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復制中間體——閉合環狀雙鏈DNA(covalently closed circular DNA ，cccDNA)是HBV復制過程中的前基因組RNA模板，其是病毒復制發生的第一步指標。HBV-cccDNA也是引起停藥后病毒學反彈的主要因素，有學者[1]已經證實血清中HBV RNA來自感染肝細胞中cccDNA的活性轉錄，血清中HBV RNA水平能反映肝細胞中cccDNA的狀態,故建議將傳統的基于病毒DNA檢測的病毒學應答重新定義為血清HBV DNA和RNA的共同持續消失(低于檢測下限)，并以此作為安全停藥的病毒學指標[1]。HBV-cccDNA是目前乙型肝炎病毒研究中的熱點DNA，國內外已有多個研究[2-5]對其檢測方法及臨床意義進行了探討，但關于血清或肝細胞中HBV-cccDNA是否與HBV感染的嚴重程度相關，目前尚存在爭論。

乙型肝炎病毒相關性腎小球腎炎(hepatitis B virus associated glomerulonephritis，HBV-GN)就是由HBV直接或間接誘發的腎小球腎炎,也是兒童繼發性腎小球腎炎的主要病因之一[6]。目前對于HBV-GN的診斷主要參照全國HBV-GN專題討論診斷標準(北京) 和《小兒腎小球疾病臨床分類和腎病綜合征治療方案》中HBV-GN的診斷標準(珠海)[7]，其診斷主要依賴腎活檢，目前對于兒童HBV-GN的治療主要以干擾素抗病毒治療為主。對于藥物療效的觀察及其預后評估多依賴于血清HBV DNA水平、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平檢測，但是這些項目的測定在HBV-GN的治療監測方面還不夠敏感。因此尋找無創檢查，增加對兒童HBV-GN的早期診斷及其抗病毒療效評估顯得尤其重要。由于血清HBV-cccDNA水平檢測在兒童HBV-GN診斷中的意義目前報道較少，因此本文作者檢測HBV-GN患兒外周血HBV-cccDNA水平，同時對10例明確診斷且規范治療的患兒進行隨訪，初步探討HBV-GN患兒外周血中HBV-cccDNA水平檢測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年9月—2016年9月甘肅省人民醫院兒科和蘭州大學附屬第一醫院感染科明確診斷為HBV-GN的初治39例患兒作為研究對象(觀察組)，所有患兒均接受肝臟和腎臟穿刺，其中男性23例，女性16例，平均年齡(10.2±5.7)歲。對照組選取肝功能正常HBV攜帶患兒40例，男性22 例，女性 18 例，平均年齡 (10.7± 5.1)歲，所有對照組患兒均未發現血尿及蛋白尿，無血尿素氮(blood urine nitrogen,BUN)及血清肌酐(serum creatinine,Scr)升高，無內生肌酐清除率(creatinine clearance,Ccr)降低等腎損害表現。2組患兒性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有肝臟、腎臟活檢病例，均向患兒家屬告知情況，本研究獲得甘肅省人民醫院倫理委員會批準同意。

1.2 診斷標準和排除標準 HBV-GN診斷標準：參照《兒童常見腎臟疾病診治循證指南(試行)解讀(五)中乙型肝炎病毒相關性腎炎診斷和治療》[7]中的診斷標準。①血清HBV標志物陽性：大多數為HBsAg、HBeAg和HBcAb同時陽性，少數為HBsAg、HBeAb和HBcAb同時陽性，個別患者血清HBsAg陰性但HBV-DNA陽性；②患腎病或腎炎并除外其他腎小球疾病：大多數表現為腎病綜合征，少數表現為蛋白尿和血尿；③腎小球中有1種或多種HBV抗原沉積：大多數有HBsAg、HBcAg或HBeAg在腎小球沉積；④腎臟病理改變：絕大多數為膜性腎病(membranous nephropathy,MN)，少數為膜增生性腎炎(membranoproliferative glomerulonephritis,MPGN)和系膜增生性腎小球腎炎(mesaugial proliferative glomerulonephritis,MsPGN)。確診標準： 同時具備上述第①、②和③條依據； 同時具備上述第①、②條依據，并且第④條依據中為MN； 個別患者具備上述第②、③條依據，血清HBV標志物陰性也可確診。僅具備第①、②條但不具備③時，不能進行診斷。HBV-GN排除標準：排除其他肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、藥物性肝損害和酒精性肝損害等肝臟疾病；排除原發性和除肝炎以外的繼發性腎臟疾病；排除腎臟腫瘤、多囊腎、孤立腎和泌尿系統結石等疾病；排除膀胱、輸尿管、外尿道和外陰疾病。

1.3 實驗室指標和HBV-cccDNA水平檢測 收集本院檢驗科提供的肝腎功能、HBV五項、HBV DNA滴度測定、尿常規和24 h尿蛋白定量等檢測結果，以上檢測結果均在治療前采集外周靜脈血完成。BUN>8.2 mmol·L-1為異常, Scr>132 μmol·L-1為異常，ALT>50 U·L-1為異常，AST>40 U·L-1為異常，Ccr<80 mL·min-1為異常。采用PCR熒光分子信標(試劑盒購自廣州藍星生物科技開發有限公司)技術檢測 ：于清晨采用一次性注射器采血，分離200 μL血清存放于-18℃保存備檢，PCR擴增：先取DNA聚合酶1.2 μL加入反應液管內(DNA聚合酶及反應液管用前需短暫離心5 s)，然后取處理后的樣本上清液、陰性對照上清液及標準 品Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各5 μL分別加入反應液管內，混勻后短暫離心5 s，上機擴增。同時設置空白對照管：空白對照只需在反應液管內加入5 μL去離子水，混勻后10 000 r·min-1離心 10 s，上機按以下程序擴增：預變性94℃、 3 min；循環條件：94℃、 35 s，55℃、 35 s，72℃、 40 s，共循環38次；72℃延伸3 min，28℃保溫8 min以上。熒光檢測：待各PCR反應液管充分冷卻至28℃后短暫離心，置于熒光檢測儀，讀取并記錄熒光值，熒光激發波長為487 nm，檢測波長為518 nm。HBV-cccDNA熒光值的計算方法：Ax值=標 本或者各對照的熒光值-空白對照的熒光值。Ax值>21 判定為陽性，反之判定為陰性。 根據HBV-cccDNA水平將39例HBG-GN患兒分為HBV-cccDNA陽性組(24例)和HBV-cccDNA陰性組(15例)。

1.4 患兒肝組織形態表現的觀察 在B超引導下行肝組織穿刺病理活檢，要求肝組織長度>1.0 cm，肝組織經固定、脫水、石蠟包埋、切片后HE染色及網狀纖維染色，光鏡下觀察肝組織形態表現，按照2000年全國病毒性肝炎學術會議修訂的標準[8]，將肝組織炎癥分為G0～G4，纖維化分為S0～S4級。

1.5 患兒腎組織形態表現的觀察 將經皮膚腎臟穿刺取得的腎組織送至蘭州大學醫學院病理教研室。光鏡觀察腎小球的病理改變，電鏡觀察腎小球的超微結構變化。免疫熒光法檢測腎組織中HBsAg、HBeAg和HBcAg檢出率， MN患兒腎組織中HBsAg、HBeAg和HBcAg病毒抗原主要沿腎小球毛細血管袢呈顆粒狀連續分布。

1.6 HBV-cccDNA診斷價值的評價 HBV-cccDNA在HBV-GN中的診斷價值采用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線及曲線下面積(area under ROC curve, AUC)進行評價。

1.7 治療后隨訪 觀察組患兒在接收抗病毒治療后第2、4、8和12周時檢測血清HBV DNA和HBV-cccDNA水平、肝腎功能、尿常規及24 h尿蛋白定量。

1.8 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。HBV-cccDNA陽性組和HBV-cccDNA陰性組患兒血中肝酶(ALT/AST)、HBeAg、血尿、蛋白尿、BUN、Scr和Ccr表達率組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HBV-cccDNA陽性和HBV-cccDNA陰性組HBV-GN患兒的肝腎功能指標 在不同年齡(≤6歲和>6歲)和不同性別HBV-GN患兒中HBV-cccDNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。HBV-cccDNA陽性組HBV-GN患兒肝酶(AST/ALT)水平異常率、HBeAg和尿蛋白陽性率均高于HBV-cccDNA陰性組患兒(P<0.05)，其余血尿、BUM、Scr及Ccr組間比較差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。HBV-cccDNA陰性組患兒中有5例無血尿和蛋白尿，其中2例雖無血尿，但患兒有乙肝病史，血清乙肝病毒標志物陽性，病毒低復制，有眼皮水腫、高血壓和補體C3降低等急性腎炎表現，排除其他腎臟疾病，腎組織活檢為膜增生性腎炎；3例患兒雖無蛋白尿，但有乙肝病史，血清乙肝病毒標志物陽性，病毒復制，有血脂高，雙下肢浮腫等腎病綜合征表現，排除其他腎疾病，腎組織活檢為MN。

表1 HBV-cccDNA陽性和HBV-cccDNA陰性組HBV-GN患兒的肝腎功能指標

Tab.1 Indexes of liver and kidney function of HBV-GN children in HBV-cccDNA positive and negative groups

[n(η/%)]

2.2 HBV-cccDNA陽性和HBV-cccDNA陰性組HBV-GN患兒肝組織炎癥和纖維化程度 肝組織炎癥活動度活躍主要集中在G0～G1，HBV-cccDNA陽性組和HBV-cccDNA陰性組患兒肝組織炎癥活動度活躍的病例數分別為18(75.0%)和12(80.0%)例，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。2組患兒中肝組織纖維化分期以S0期為主，HBV-cccDNA陽性組和HBV-cccDNA陰性組HBV-GN患兒S0期病例數分別為13(54.2%)和9(60.0%)例，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 HBV-cccDNA陽性和HBV-cccDNA陰性組HBV-GN患兒肝組織炎癥和纖維化程度

Tab.2 Degrees of inflamination and fibrosis of liver tissue in HBV-GN children in HBV-cccDNA positive and negative groups

GroupnInflammation degree (G0-4)G0G1G2G3G4Fibrosis degree(S0-4)S0S1S2S3S4HBV-cccDNA positive24810411134232HBV-cccDNA negative156621094110χ20.9252.095P1.0000.775

2.3 HBV-GN患兒腎組織中HBsAg、HBeAg和HBcAg檢出率 39例HBV-GN患兒經腎臟穿刺活檢確診為HBV-GN，其中32例MN、5例MPGN和2例MsPGN。32例MN患兒中有25例患兒腎小球中檢測出HBV抗原，5例MPGN患兒中2例患兒檢出HBV抗原，2例MsPGN患兒中未檢出HBV抗原，MN患兒中腎小球HBV抗原檢出率明顯高于MPGN及MsPGN患兒(78.1%vs28.6%vs0%，P=0.02)。免疫熒光法檢出MN患兒腎組織中有HBsAg、HBeAg和HBcAg陽性形態表現，其中3種病毒抗原主要沿腎小球毛細血管袢呈顆粒狀連續分布，見圖1(插頁五)。HBV抗原成分的檢出以HBeAg和HBcAg為主(表3)。cccDNA陽性組患兒HBeAg和HBcAg的檢出率明顯高于HBV-cccDNA陰性組(P<0.05)，2組患兒HBsAg檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 HBV-GN患兒的HBV抗原分布

2.4 HBV-cccDNA水平檢測診斷HBV-GN患兒的敏感性和特異性 采用ROC曲線評價HBV-cccDNA水平能否作為HBV-GN患兒輔助診斷的一個潛在標志，結果顯示：HBV-cccDNA水平檢測能有效鑒別觀察組和對照組患兒，AUC=0.804(95%CI：0.709～0.883)；在血清HBV-cccDNA(log)值為7.6時，其診斷HBV-GN的敏感度和特異度分別為98%和100%。見圖2。

2.5 HBV-GN患兒治療隨訪中HBV-cccDNA水平 39例HBV-GN患兒中規范抗病毒治療者10例，其中男性8例，女性2例，該10例患兒血中HBeAg均呈陽性，AST水平升高者2例，以肉眼血尿為主要表現者2例，以大量蛋白尿為主要表現者8例，8例MN和2例MPGN患兒均未見腎功能不全。對該10例患兒建立長期隨訪資料。在抗病毒治療后2、4、8和12周時檢測血清HBV DNA及HBV-cccDNA水平，在治療前和治療后第2、4、8、12周時HBV DNA的中位水平分別為6.8 、6.5、4.8、3.5和2.5；在治療前和治療后第2、4、8、12周時HBV-cccDNA的中位水平分別為5.8、 5.0、3.2、2.4和2.0。

圖2 HBV-cccDNA診斷HBV-GN的ROC曲線

Fig.2 ROC curve of HBV-cccDNA in diagnosis of HBV-GN

治療至第12周時其中7例患兒HBeAg轉陰，無蛋白尿和血尿癥狀，ACT和AST水平均正常；而3例患兒HBeAg仍呈陽性，尿蛋白持續陽性，繼續治療至6個月，仍無明顯改變。治療無效的3例患兒外周血HBV DNA和HBV-cccDNA水平檢測結果顯示：治療前該3例患兒血液標本中HBV-cccDNA水平(7.3、6.8和6.4)均高于其余7例標本(6.2、5.8、5.8、5.2、4.8、4.3和3.8)。 在治療第2周時患兒外周血HBV-cccDNA水平明顯降低，且下降速度較HBV DNA快，至治療12周時HBV-cccDNA下降水平可達2個對數級。

3 討 論

HBV-GN是我國兒童常見的繼發性腎小球疾病之一，也是兒童期MN的主要原因[9]，其發生與HBV感染有密切關系，發病率也大致與HBV感染率平行。而兒童免疫功能尚未發育完善，故HBV-GN發病率明顯高于成人[9]，其臨床表現以不同程度蛋白尿、標志物陽性、鏡下血尿及肝腎功能損害為主要特征。2006年我國乙型肝炎流行病學調查[10]結果表明：1～59 歲人群HBsAg攜帶率為7.18%，而其中HBV-GN發生率為6.8%～20.0%。目前對于慢性感染者來講，抗病毒治療面臨著兩個問題：第一，清除細胞質中病毒DNA復制；第二，耗竭細胞核中的HBV-cccDNA。HBV- cccDNA是HBV復制過程中的前基因組RNA模板，國內外多項研究[3,5,11-12]結果表明：HBV-cccDNA的復制是HBV持續感染和HBV復制的突出標志，是評價HBV感染狀態和藥物療效的重要指標。研究[12-13]顯示：血清HBsAg水平與具有轉錄活性的cccDNA水平密切相關，反映了HBV-cccDNA在肝細胞中的復制情況可作為替代肝組織中HBV cccDNA檢測的潛在指標,但有關HBsAg的轉錄、調控及清除機制目前尚未闡明，尤其融合在宿主基因組的HBV DNA轉錄生成HBsAg的調控機制尚有待進一步深入研究。目前對于HBV-cccDNA的研究多集中于HBV-cccDNA的檢測及其在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的診斷及抗病毒預后指導方面[14-17]，而其對兒童HBV-GN的診斷及治療價值報道較少。

本研究結果提示：HBV-cccDNA陽性患兒肝酶水平、HBeAg和尿蛋白陽性率均高于HBV-cccDNA陰性患兒，提示HBV-cccDNA的復制水平與患兒肝腎功能的損害有關。本課題組既往研究[18]結果表明：CHB患兒隨著病情的加重，HBV-cccDNA檢出率升高，HBV-cccDNA的檢測結果可以反映該病的嚴重程度。當肝臟組織處于炎癥活動階段時, 存在于肝細胞質和線粒體中的轉氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中, 存在于肝細胞核中的HBV-cccDNA在肝細胞變性和壞死時也可以釋放到血液中，且病情越嚴重，變性壞死的細胞越多[19]。由于HBV-cccDNA存在于肝細胞核中，因此采用肝組織檢測cccDNA 結果較為可靠和準確，但肝臟穿刺活檢屬于有創性檢查，在臨床難以普及，故檢測外周血中HBV-cccDNA水平更易于被接受，同時也能較好地反映病毒復制狀態。本研究同時分析了HBV-cccDNA復制與肝臟病理炎癥分級及纖維化分期的關系，并未發現HBV-cccDNA與肝臟的病理變化有關聯。根據本實驗結果推測可能原因： 在兒童乙型肝炎早期，由于腎小球局部病毒復制或者循環中HBV感染的細胞在腎小球局部滯留，導致HBV-cccDNA在腎小球局部滯留，肝組織中HBV-cccDNA復制水平較低; 本實驗所選標本量較小，HBV-cccDNA能否引起肝臟炎癥及纖維化的加重，還需進一步大樣本的研究證實。

MN和MPGN是兒童HBV-GN的主要病理類型[9], 而本研究中HBV-GN患兒的腎臟病理類型與以上結果一致，進一步分析結果顯示：MN患兒的腎小球HBV抗原檢出率明顯高于MPGN患兒，而HBV抗原成分的檢出以HBeAg及HBcAg為主，這與崔敏等[6]的研究結果相似，HBV-cccDNA陽性組患兒HBeAg和HBcAg檢出率均明顯高于HBV-cccDNA陰性組。研究[6]顯示：HBV-GN患者腎小球中檢測到了HBV-cccDNA的存在，且HBV-cccDNA出現與循環中HBV-cccDNA檢出高度一致，說明HBV抗原的檢出與HBV-cccDNA的復制有關聯，但這具體是由于腎小球局部病毒復制所致還是循環中HBV感染的細胞在腎小球局部滯留或是被細胞吞噬的病毒顆粒，還有待于進一步的定位研究。

急性自限性乙型肝炎(acute self limiting hepatitis B，AHB)患者和抗病毒治療后實現持續性病毒學反應和HBsAg血清學清除的CHB患者肝細胞中存有極微量的HBV-cccDNA，肝細胞中HBV-cccDNA水平有望成為預測抗病毒治療預后的可靠指標[20]。研究[5]顯示：乙型肝炎患者外周血單個核細胞中HBV-cccDNA水平對其抗病毒治療效果的監測和預后判斷均有重要的臨床意義。本研究首次應用ROC曲線評價HBV-cccDNA表達水平能否作為HBV-GN患兒輔助診斷的一個潛在標志，結果顯示：HBV-cccDNA水平檢測能有效鑒別觀察組HBV-GN患兒和對照組患兒，說明HBV-cccDNA水平檢測對診斷HBV-GN具有一定的臨床價值。對10例干擾素規范抗病毒治療兒童隨訪結果顯示:HBV-cccDNA水平降低較HBV DNA水平降低出現早，且在3例治療效果不理想患兒中其治療前HBV-cccDNA復制水平均高于其他7例患兒，提示在治療初期檢測血清HBV-cccDNA水平較HBV DNA水平更為敏感，且對治療效果的評估存在潛在的研究價值。在未來大樣本的臨床研究基礎上可以考慮將血清HBV-cccDNA水平檢測納入HBV-GN的診斷，以更好地評估病情及治療效果。

綜上所述，HBV-cccDNA復制可能參與HBV-GN患兒的肝腎損害，且與腎小球免疫復合物沉積相關。HBV-cccDNA是HBV-GN發病過程中的一個關鍵分子，檢測其復制水平可用于HBV-GN患兒的輔助診斷和疾病狀態監測，同時對療效評估及預后的判斷具有潛在的臨床應用價值。