microRNA在牙發育和萌出中作用的研究進展

劉蒼維，張 雪，胡 月，郝新青，趙 歡，李 媛，閆廣興，周怡君，史 冊，孫宏晨

(1.吉林大學口腔醫院病理科,吉林 長春130021;2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春130021)

微小RNA(microRNA, miRNA)作為非編碼RNA中的一種，自被發現以來就備受關注。已有研究[1]證實：miRNA可參與細胞的增殖、分化和器官發育等過程。miRNA通過與靶mRNA的3′非編碼區(3′ untranslated region, 3′ UTR)互補配對，使得靶序列降解或是翻譯受到抑制，從而在轉錄后水平調控基因的表達。此外，也有研究[2]顯示miRNA可直接或間接激活基因表達。牙發育是一個上皮和間充質相互作用的復雜過程，其中涉及到很多信號通路和蛋白，miRNA可通過影響牙發育相關分子(信號分子和轉錄因子等)進而影響牙發育過程。此前國內已有綜述[3]闡述miRNA對釉質和牙本質發育及進化的作用，但其對參與釉質及牙本質發育miRNA的介紹不夠全面及完整，且近年來miRNA對牙發育的研究又有部分新進展。因此，本文就miRNA在牙發育各時期的表達、miRNA對牙本質和釉質形成及牙萌出的影響進行綜述，為牙發育的生物學機制的研究提供新思路。

1 miRNA的形成和作用機制

miRNA是一段由19～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，在轉錄后水平負向或正向調控基因的表達。miRNA合成在細胞核中開始，在RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的作用下，以miRNA基因序列為模板，先合成具有莖環結構的初級miRNA(primary miRNAs, pri-miRNAs)。在哺乳動物中，經RNase Ⅲ核酸內切酶Drosha作用打開莖環，變成前體miRNA(precursor miRNAs, pre-miRNAs)后出細胞核。進入細胞質后，pre-miRNA在另一種RNase Ⅲ核酸內切酶Dicer作用下，變成成熟的miRNA[1]。

miRNA負向調控基因表達的功能是通過RNA介導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex， RISC)來完成的。RISC的核心成分是AGO家族蛋白，miRNA與AGO結合后，形成miRNA效應復合物(miRNA-RISC)，發揮負向調控基因表達的作用[4]。miRNA通過5′端的長度為5～7個核心核苷酸的“種子序列(seed region)”與靶mRNA的3′ UTR實現特異性配對，從而在轉錄后水平減弱蛋白質的翻譯或降低mRNA的穩定性[5-6]，而miRNA-RISC對靶mRNA的抑制方式是由miRNA與靶mRNA之間的配對程度決定的。大部分植物miRNA與靶mRNA高度配對，通過類似小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的作用方式，引起靶mRNA的切割或降解；但大部分動物miRNA與靶mRNA為不完全配對，需通過翻譯抑制來減弱基因表達。

除負向調控基因的表達外，研究[2]表明：miRNA在不同種的細胞或同種細胞不同狀態下具有直接或間接激活基因表達的能力，但其具體機制尚不十分明確。如miRNA-551b-AGO1復合體與RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ, RNA Pol Ⅱ)結合后，可促進STAT3募集轉錄因子TWIST1，并進一步激活其表達。因此研究人員提出可能是由AGO蛋白將miRNA轉運至細胞核后，miRNA與啟動子相結合，從而促進轉錄因子和RNA PolⅡ與啟動子的結合，進而激活下游靶基因的表達[7]。

2 miRNA在牙發育中的作用

牙發育是外胚層來源的上皮和神經嵴來源的間充質相互作用的結果[8]。牙發育過程大致包括形態發生[9]、牙本質形成和釉質形成[10]。形態發生又包括起始期、蕾狀期、帽狀期和鐘狀期[11]。帽狀期可見牙胚形態，牙胚由成釉器、牙乳頭和牙囊三部分組成。成釉器由上皮分化而來，鐘狀期成釉器分為外釉上皮、星網狀層、中間層和內釉上皮；牙乳頭和牙囊由間充質細胞分化形成。鐘狀期晚期，靠近內釉上皮的牙乳頭細胞開始分化為成牙本質細胞，成牙本質細胞分泌的牙本質基質蛋白礦化形成牙本質。隨后，靠近牙本質的內釉上皮分化為成釉細胞，釉質形成開始。牙本質形成后，牙乳頭即為牙髓。牙冠發育完成后，成釉器頸環處的內釉上皮和外釉上皮向根方延伸，形成位于牙乳頭和牙囊之間只有2層上皮細胞組成的上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath, HERS)[12]。隨著HERS向根部延長，臨近HERS內層的牙乳頭細胞在HERS分泌的細胞因子誘導下，分化為成牙本質細胞，形成根部牙本質。隨后，HERS呈網狀斷裂，牙囊細胞穿過孔隙與新形成的牙本質接觸，被誘導分化為成牙骨質細胞，形成牙骨質。此外，一部分HERS細胞也可分化為成牙骨質細胞，參與形成牙骨質[13]。與此同時，前成纖維細胞遷移至牙根和牙槽骨表面，分泌膠原纖維，參與形成牙周膜纖維。隨著牙根的發育和伸長，牙逐漸萌出至口腔并建立正常的咬合關系，發揮咀嚼和發音等功能。

為了確定miRNA在牙發育中的重要作用，研究者[14]利用Cre-loxP系統敲除牙胚中的Dicer1基因，在小鼠體內采用K14-Cre條件性敲除胚胎外胚層細胞的Dicer1基因后，牙的形狀和磨牙牙尖的形態發生了改變，成釉細胞的分化和釉質的形成也受到影響，這與Pitx2-Cre條件性敲除胚胎外胚層中Dicer1基因的研究[15]結果相似，表明上皮細胞中的miRNA在牙發育中起重要的作用。采用Wnt1-Cre敲除間充質中的Dicer1基因，表現為胚胎上頜牙形態異常，下頜牙發育停留在帽狀期[16]。上與下頜牙比較，不同的發育異常表型說明存在其他機制調節miRNA的功能。上述研究表明：牙形態的正常發育需要miRNA，并且上皮和間充質中的miRNA對牙發育均有調節作用。

2.1 牙發育過程中miRNA的表達 牙發育過程中，無論是在外胚層還是間充質中均有特異的miRNA表達譜。分析小鼠胚胎15.5 d(embryonic day 15.5, E15.5)、出生后第0天(postnatal day 0, PN0)和出生后第5天(postnatal day 5, PN5)的下頜第一磨牙牙胚中miRNA表達的研究[17]結果顯示在牙發育過程中miRNA表達是動態變化的。有31種miRNA只在出生前的發育過程中表達，這31種miRNA特異性地調節細胞的生長和分化。小鼠切牙唇側頸環處的成釉細胞在不同的分化階段miRNA表達譜也不同[18]。分析小型豬下頜磨牙牙胚發育的蕾狀期、帽狀期、鐘狀期早期和鐘狀期晚期中miRNA的表達譜[19]結果顯示涉及到的miRNA達166種。體外誘導人牙髓干細胞向成牙本質細胞分化過程中，所鑒定的有12種miRNA表達上調，10種表達下調[20]。總之，在牙發育過程中miRNA表達譜十分復雜,貫穿了牙發育的整個過程。

2.2 miRNA參與調控牙本質的形成 牙本質是由成牙本質細胞分泌的牙本質基質礦化后形成的。成牙本質細胞由牙乳頭細胞分化而來，這一分化過程主要受Wnt、Notch、轉化生長因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)和音猥因子(sonic hedgehog, SHH)等信號的調控。這些信號通路在牙發育的不同時間點通過影響細胞的生物學行為(包括增殖、凋亡、細胞骨架重排、終末分化和細胞外基質的合成等)來調控牙發育。此外，成牙本質細胞分化過程中也受其他重要分子的調控，如Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix, OSX)、牙本質涎磷蛋白(dentin sialophophoprotein, DSPP)和同源盒轉錄因子3(distal-less homeobox 3, DLX3)等。miRNA通過調節上述信號通路和相關分子進而調控牙本質的形成。見表1。

表1 牙本質形成過程中相關miRNAs及其靶基因

DSPP是一種在牙發育過程中可以高特異性標志成牙本質細胞的牙本質基質蛋白。研究[21]表明:miR-32、miR-885-5p和miR-586在成牙本質細胞分化過程中可在轉錄后水平調節DSPP的表達，但具體機制尚不十分明確。在小鼠的成牙本質細胞和人牙髓細胞分化過程中，miR-665表達下調，導致miR-665與Dlx3 mRNA的3′ UTR結合減少，Dlx3 mRNA的降解減少，DLX水平升高，正性調控DSPP的表達[22]。

miR-34a可以抑制Notch和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信號通路。因為Notch活化抑制細胞分化，所以當miR-34a抑制Notch信號通路后，可以促進根尖乳頭干細胞(stem cells from apical papilla, SCAPs)分化并使SCAPs中的DSPP表達水平上調。在根部牙本質發育過程中，熒光素酶分析發現miR-34a可以直接與NOTCH2和HES1的3′ UTR結合，從而抑制Notch信號通路。研究者[23]采用Notch信號通路的配體JAG1處理SCAPs后，miR-34a表達上調，采用Notch信號通路的抑制劑DAPT處理SCAPs后miR-34a表達下調。因此，miR-34a與Notch信號通路間存在微調控環路。人牙乳頭細胞轉染miR-34a mimic后，BMP7的表達水平降低，而當轉染miR-34a抑制劑后，BMP7表達水平升高[24]。因此，miR-34a可通過靶向BMP7促進人牙乳頭細胞向成牙本質細胞方向分化。

小鼠牙乳頭細胞轉染miR-27 mimic和miR-663 mimic后，以結腸腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白水平降低、β-catenin轉移進細胞核為先導的礦化進程加快[25]，miR-27和miR-663均可與APC蛋白的3′ UTR相結合[26]。這一發現也與Wnt信號通路被激活后其在成牙本質細胞分化中的重要作用一致，上述研究結果說明miR-27和miR-663可通過抑制APC蛋白的表達激活Wnt信號通路，從而促進牙本質的發育。

體外研究[27]顯示：過表達miR-135b可抑制人牙髓細胞向成牙本質樣細胞分化，并抑制SMAD5和SMAD4的表達。熒光素酶分析結果表明：miR-135b通過與SMAD5和SMAD4的3′ UTR相結合并抑制這2種基因的表達。

miR-338-3p通過抑制Runx2促進成牙本質細胞的分化。Runx2是成牙本質細胞分化過程中一種重要的轉錄因子，miR-338-3p可以下調Runx2的表達。研究[28]顯示：抑制miR-338-3p表達可使小鼠牙乳頭細胞分化停止，增強miR-338-3p表達可以促進小鼠牙乳頭細胞的分化，表明miR-338-3p在間充質干細胞分化為成牙本質細胞中起十分重要的作用。

miR-143和miR-145表達下調在成牙本質細胞分化中也是必要的[29]，過表達miR-143和miR-145會延遲成牙本質細胞的分化和牙本質形成。Kruppel-like factor 4(Klf4)和Osx在成牙本質細胞分化過程中發揮重要作用，miR-145直接與Klf4和Osx基因的3′ UTR區結合，從而在轉錄后水平抑制其表達。miR-143通過miR-145間接調節Osx的表達，同時Klf4直接抑制miR-143的表達[30]，表明miR-143和miR-145通過1個調控環路參與成牙本質細胞的分化。

2.3 miRNA參與調控釉質發育 釉質是鐘狀期晚期由成釉細胞分泌的基質礦化后形成的。成釉細胞的發育一般分為分泌前期、分泌期、轉化期、成熟期和成熟后期5個時期。分泌前期的細胞為前成釉細胞，分泌前期的結束意味著細胞分化的完成，即成釉細胞的形成。miRNA通過影響成釉細胞分化過程、釉質基質分泌過程和釉質礦化過程影響釉質的形態。見表2。

表2 釉質發育過程中相關miRNAs及其靶基因

嚙齒動物的切牙頸環處存在可持續分化的祖細胞，因此其切牙可以持續伸長。miRNA在位于唇側頸環處的上皮祖細胞向成釉細胞分化過程中發揮重要作用。從祖細胞到前成釉細胞這一轉變過程是由祖細胞表達的PITX2啟動，而前成釉細胞不表達PITX2。PITX2通過在祖細胞中促進miR-200c/141表達來啟動這一轉變過程。體內研究[31]顯示：miR-200c/141敲除的小鼠表現為下頜切牙釉質礦化缺陷和第三磨牙萌出異常。體外研究[31]顯示：miR-200c抑制Noggin表達，促使BMP信號表達上調，進而保持前成釉細胞中miR-200c/141的表達，構成了一個正反饋通路。

此外，miR-96-5p和miR-exon4也參與調控成釉細胞的分化。TBX1、PITX2、miR-96-5p和miR-200c間存在1個調控通路，TBX1可與PITX2相互作用并可抑制miR-96-5p表達[32]。當祖細胞開始分化時，miR-96-5p表達增加，反之抑制Tbx1表達，隨后引起Amelx表達上調，從而使細胞增殖率降低。miR-exon4通過調節Runx2的表達參與成釉細胞的分化。體內研究[33]顯示：釉原蛋白基因敲除小鼠的miR-exon4表達量減少，Runx2及其下游基因的表達水平均下調。體外向成釉細胞樣細胞(LS-8)轉染miR-exon4 mimic后，Runx2的表達水平明顯上調[33]。

研究[34]顯示：miR-26b過表達小鼠表現為切牙和磨牙缺失等發育異常。miR-26b的表達水平與Lef-1的表達呈負相關關系，miR-26b靶向抑制Lef-1的轉錄活性，使得細胞周期蛋白D1(cyclinD1)等增殖相關蛋白表達減少，從而抑制上皮祖細胞的增殖，引起牙發育異常。

miRNA通過影響TGF-β/BMP信號通路調節釉質發育。體內研究[35]顯示miR-214通過影響TGF-β信號通路間接影響釉質的發育。在小鼠磨牙牙胚中轉染anti-miR-214引起部分釉質生物合成所必需的蛋白水平下降，導致釉質礦化不全和酸蝕后表面粗糙度降低。基因芯片技術分析結果顯示：轉染anti-miR-214后，導致其可能的靶基因凝集素(clusterin, CLU)和TGF-β1的表達下調，這2種蛋白質在釉質發育過程中起重要作用[36]。在小鼠腎囊下移植轉染miR-135a的磨牙牙胚發現：miR-135a過表達可引起BMPR-ⅠA和BMPR-ⅠB蛋白水平降低，pSMAD-1/5/8水平降低和BMP信號通路表達水平降低[37]。另一方面，腎囊下培養時加入外源性BMP-2可以抑制miR-135a的表達。此外，體外研究[31]顯示：miR-203可靶向結合Bmper的3′ UTR的保守序列，其與miR-200c的作用類似，可調節LS-8細胞的分化。

熒光素酶檢測結果顯示：miR-720與Fgf8 mRNA的3′ UTR結合，參與微調控牙上皮干細胞中Sox2表達[38]。Sox2是牙上皮細胞的特異性標志物，受牙發育起始標志物FGF8的調控。此外，miR-200b在轉錄后水平參與牙上皮干細胞中Sox2的表達。

此外，miR-224通過與Slc4a4和CFTR mRNA的3′ UTR相結合，調控成釉細胞分化過程中的離子轉運，維持pH穩態，參與釉質的礦化[39]。miR-153參與調節釉質發育成熟的過程。與分泌期成釉細胞比較，成熟期成釉細胞中miR-153的表達水平明顯下調。在成釉細胞樣細胞中miR-153表達水平上調，可抑制其靶基因如Cltc、Lamp1、Clcn4和Slc4a4的表達[40]。miR-182 和miR-141通過調節晝夜節律相關因子Clock和Bmal1表達，參與調節牙發育過程中的晝夜節律。晝夜節律對釉質的發育十分重要，可能影響釉質的形態[41]。

3 miRNA在牙萌出中的作用

牙萌出需要通過牙槽骨的改建來實現。牙萌出分為2種類型，一種是限制性萌出，如人牙和小鼠磨牙的萌出過程；另一種是持續性萌出，如小鼠切牙。牙萌出分別受不同的分子和機制所調節，其中持續性萌出的動力主要來自于切牙頸環，頸環處干細胞不斷增殖分化，不斷形成釉質和牙本質，促使牙齒的不斷伸長。限制性萌出過程與牙槽骨的改建關系更為緊密，因此以下簡要介紹限制性萌出。

牙槽骨由牙囊發育而來，牙囊來源于具有多向分化潛能的顱神經嵴間充質。顱骨鎖骨發育不良(cleidocranial dysplasia, CCD)是一種常染色體顯性遺傳病，Runx2基因突變是主要病因，表現為先天性骨骼系統的發育畸形，其中典型口腔異常癥狀包括乳牙滯留、恒牙遲萌和多生埋伏牙。Runx2既可以調節成骨細胞分化，又可以通過直接或間接作用于OPG/RANK/RANKL軸影響破骨作用。CCD患者的Runx2基因突變不僅影響牙囊細胞的增殖分化，而且抑制牙胚底部的骨形成及牙胚頂部的骨吸收過程，從而阻礙牙萌出。篩選Runx2突變牙囊細胞和正常人牙囊細胞差異表達miRNA的研究[42]顯示：Runx2突變牙囊細胞較正常對照牙囊細胞miR-146a和miR-335表達均下調10倍以上，而miR-146a過表達后，Runx2、CSF-1和OPG等基因表達下調，盡管該研究尚未驗證牙萌出是否異常，但Runx2基因突變后牙囊細胞中miRNA表達的改變為研究牙萌出提供了新思路。

4 展 望

牙發育是上皮和間充質相互作用和相互誘導的結果，這一過程受到多種信號分子和轉錄因子的共同調節。miRNA在牙發育過程中的表達具有時間和空間特異性。明確miRNA在牙發育過程中對相關信號分子和轉錄因子的作用，有助于進一步了解和完善牙發育中上皮和間充質的信號傳遞。此外，miRNA對靶基因的調控并不是單向的，而是存在反饋通路。需要注意的是，多種miRNA之間存在協同或拮抗作用，一種miRNA可作用于多個靶基因，多種miRNA也可作用于同一個靶基因。簡單調控一種miRNA很難達到調控某一種基因表達的目標。據估計，miRNA參與調控人類基因組中60%的基因，目前只有一小部分miRNA已經確定參與了牙發育過程中牙本質、釉質的形成和牙萌出，miRNA對牙根發育的調控作用尚未見報道。此外，miRNA對牙發育的研究絕大多數仍停留在作用機制方面，距離其臨床應用仍有較大空間，如牙再生等。因此，miRNA在牙根發育中的作用以及從miRNA的機制研究轉化為臨床應用是未來的發展趨勢和研究方向。