木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑對臘肉品質的影響

周慧敏，張順亮，趙 冰，李 素，潘曉倩，任 雙，曲 超，成曉瑜*

（中國肉類食品綜合研究中心，國家肉類加工工程技術研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

臘肉是以鮮（凍）畜肉為主要原料，配以其他輔料，經腌制、烘干（風干）、煙熏（或不煙熏）等工藝加工而成的非即食肉制品[1]，從廣義上講也屬于低酸發酵肉制品（pH≥5.5）。雖具有風味濃郁、可常溫貯藏、食用方便等特點，深受廣大消費者的青睞，但仍面臨一些問題，一方面工藝落后，生產周期長，成本高；另一方面采用自然發酵，易受到雜菌污染，導致產品質量不穩定和不可控[2]。因此臘肉實現工業化生產已成為大勢所趨。企業雖然采用快速腌制和高溫烘烤加工工藝，大幅縮短了生產周期（3～4 d）、減少了庫存量并提高了產品的衛生狀況，但因風干成熟期短且采用高溫烘干工藝，既加速了脂肪氧化，又缺失了微生物發酵對產品風味的貢獻，導致產品的風味與傳統工藝生產的臘肉相比，仍存在一定的缺陷[3-7]。因此解決工業化產品風味方面的問題是現代工業化臘肉制品生產的關鍵。

自從國外將發酵劑應用于肉制品中，西式發酵肉制品成功崛起，吸引了眾多研究者分離篩選出適宜生產肉制品的發酵劑菌株[8]，并進一步深入研究發酵菌株改善產品品質[9-12]及產生風味物質機理[13-14]方面的相關研究。目前開發的肉用商業發酵劑有清酒乳桿菌屬、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌屬、青霉及漢遜氏德巴利酵母菌等[10,13-14]。葡萄球菌具有護色增香的功效，通過產硝酸還原酶和過氧化氫酶等促進發色，且其代謝產物通過分解蛋白質和脂肪釋放出更多的香氣物質，在發酵肉制品的風味形成中起重要作用[15-16]，一直是國內外研究的熱點。

國內目前關于葡萄球菌的篩選及在發酵香腸中的應用研究較多，如潘曉倩等[17]研究發現葡萄球菌商業發酵劑對北方風干香腸色澤和風味具有改良作用；孫為正等[18]發現葡萄球菌和巨球菌可以顯著降低廣式臘腸產品中的亞硝酸鹽殘留量。于海等[19]發現葡萄球菌YD25對發酵香腸中揮發性風味物質的含量影響顯著，且其含量比例因不同工藝條件而發生相應的變化。而關于葡萄球菌發酵劑對臘肉品質的影響相關的研究并不多，甚至利用葡萄球菌發酵劑優化工業化生產臘肉的品質相關研究鮮見報道，由于不同產品之間工藝存在差異，且臘肉為低酸發酵肉制品。基于前期針對幾種商業發酵劑的種類及其添加量對臘肉產品感官品質的影響，優選出不產酸耐鹽耐高溫的木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑T-SC-200。

因此，本實驗以不添加發酵劑的臘肉為空白對照，對比分析產品的理化指標、微生物特性，應用氣相色譜-質譜-嗅聞儀聯用分析香氣活性化合物組成，同時進行感官評價和電子鼻分析，研究木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑T-SC-200對產品品質的影響，以期為該技術的產業化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原輔料：帶皮豬后腿肉 北京鵬程食品有限公司；加工用輔料 中國肉類食品綜合研究中心香辛料部；木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑T-SC-200（活菌量0.95×1010CFU/g） 科漢森（北京）貿易有限公司；混合發酵劑的相關資料見表1。

表1 T-SC-200混合發酵劑的生理學資料Table 1 Physiological properties of starter culture mixture T-SC-200

培養基：MRS培養基、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂、甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol and sodium chloride agar，MSA）培養基、平板計數瓊脂 北京陸橋技術有限責任公司；含溴甲酚紫的MRS培養基：1 L MRS培養基中添加1.4 mL 1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液。

2-甲基-3-庚酮、C8～C20系列正構烷烴 美國Sigma-Aldrich公司；正己烷（色譜純） 德國默克公司；冰醋酸、三氯甲烷、無水乙醇、乙醚、無水硫酸鈉、可溶性淀粉、氫氧化鉀標準液 北京化工廠；硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二鈉、1,1,3,3-四乙氧基丙烷 國藥集團化學試劑有限公司；碘化鉀 西隴化工股份有限公司；三氯乙酸 天津市福晨化學試劑廠；硫代硫酸鈉標準液天津市津科精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

DZ-600/2S型真空包裝機 山東小康機械有限公司；HWS-150型恒溫恒濕箱 上海森信實驗儀器有限公司；CR-400色差計 柯尼卡美能達（中國）投資有限公司；煙熏爐 嘉興艾博實業有限公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；TG-Wax MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、TRACE 1310型氣相色譜-TSQ 8000型質譜儀 美國Thermo公司；sniffer 9000嗅聞器 瑞士Brechbühler公司；Tenax TA石英玻璃吸附管、Gerstel TDS半自動熱脫附進樣器、TC-200型Tenax-TA吸附管自動凈化儀 德國Gerstel公司；SCIENTZ-11 L型無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；水分活度儀 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 臘肉的加工[5-7]

帶皮鮮后臀肉修整成規則的形狀（長15～20 cm，寬5～7 cm，厚3～4 cm）。輔料（按肉質量計，質量分數）：食鹽2.2%、白砂糖0.5%、葡萄糖0.5%、二鍋頭白酒0.6%、味精0.15%、異抗壞血酸鈉0.1%、NaNO20.002%、水5%。

原料→修整→紫外照射（20 min）→將腌制液和發酵劑菌粉混勻注射接種在肉中（T-SC-200發酵劑終接種量2×105CFU/g）→真空滾揉腌制（4 ℃，滾揉15 min+休息45 min，共24 h）→發酵（30 ℃，70%相對濕度，24 h）→一次烘干（40 ℃，60%相對濕度，2 d）→二次烘干（45 ℃，40%相對濕度，1 d）→包裝即得成品，共重復做3 批次

1.3.2 常規理化指標測定

pH值測定：根據GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[21]的方法；水分含量測定：根據GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[22]的直接干燥法；水分活度測定：采用水分活度儀。

1.3.3 色澤測定

使用色彩色差計進行測定，記錄亮度值（L*）、紅度值（a*）及黃度值（b*），每組樣品取6 個不同的切面，每個切面取3 點，取平均值[17]。

1.3.4 感官評價

臘肉成品真空包裝后于室溫（25 ℃）貯藏1 周平衡水分，再進行感官分析。參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規范》[23]制定感官評分標準，對添加發酵劑和空白組的臘肉樣品進行感官評價，由10 名受培訓人員組成的感官評定小組，將臘肉切成2 mm左右的薄片蒸煮15 min，通過盲評計分，評分指標包括色澤、香氣、口感及整體接受度4 方面，計分采用10 分制，評分標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of dry-cured meat

1.3.5 脂肪分解氧化指標測定

酸價的測定：稱取100 g絞碎試樣于500 mL具塞三角瓶中，加1～2 倍乙醚（30～60 ℃沸程）振蕩60 min后，放置過夜，過濾后減壓蒸餾得到的油脂，參考GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》[24]冷溶劑法測定。

過氧化值的測定：樣品處理同酸價的方法，得到的油脂參考GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[25]中的滴定法測定。

丙二醛含量的測定：參考GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[26]的分光光度法測定。

1.3.6 蛋白質降解指數測定

總氮含量測定：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[27]檢測粗蛋白的含量，表示為總氮含量。

非蛋白氮含量的測定：取20 g臘肉瘦肉加25 mL 5%三氯乙酸溶液，用研磨機研磨3 min，用100 mL 5%三氯乙酸溶液洗滌研磨杯并將勻漿轉移到250 mL燒杯中，靜置30 min，期間攪拌4～5 次。然后用無氮濾紙進行抽濾，并用少量（50 mL）5%三氯乙酸溶液洗滌沉淀，收集濾液定容到250 mL，最后采用凱氏定氮法測定[28]。

蛋白質降解指數按公式（1）計算：

式中：NPN為非蛋白氮質量分數/%；TN為總氮質量分數/%。

1.3.7 微生物的測定

菌落總數的測定：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》計數[29]；乳酸菌總數的測定：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[30]，依據菌落特征篩選菌體邊緣變黃進行計數；葡萄球菌總數的測定：用MSA培養基，（36±1）℃培養（48±2）h，依據菌落特征篩選菌體周圍有透明圈且培養基顏色變為黃色進行計數[17]；大腸桿菌總數的測定：參照GB 4789.41—2016《食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》[31]平板計數法。

1.3.8 揮發性風味物質和香氣活性化合物的測定

1.3.8.1 揮發性風味物質的吹掃/捕集-熱脫附前處理

揮發性風味物質的前處理方法參考文獻[32]。

1.3.8.2 氣相色譜-質譜-嗅聞法測定樣品中揮發性風味物質

氣相色譜條件和質譜條件的設定參考文獻[32]。

嗅覺檢測器：接口溫度150 ℃。用預處理后的樣品對3 位評價員培訓后進行實驗，評價員在嗅覺檢測口記錄下聞到的氣味時間、香味特性及香氣強度。3 位評價員的描述一致才可以確定香味活性化合物[20]。

1.3.8.3 揮發性風味成分鑒定

定性：通過軟件檢索，與NIST譜庫提供的譜圖鑒定化合物，僅當正反匹配度均大于750（最大值1 000）的鑒定結果才給予列出，并標記為MS；通過系列正構烷烴計算出未知化合物的保留指數（retention index，RI）值，并與文獻進行比對，一致者標記為RI；評價員嗅聞到的氣味與文獻報道的芳香特性對比，相符者予以標記為O。RI值[20]按公式（2）計算：

式中：RI值為樣品a的保留指數；Ta為樣品a的保留時間/min（在正構烷烴Cn和Cn+1之間）；Tn為正構烷烴Cn的保留時間/min；Tn+1為正構烷烴Cn+1的保留時間/min。

半定量：根據已知內標2-甲基-3庚酮的含量對揮發性組分進行定量分析，計算公式（3）如下所示：

式中：CX為未知揮發性化合物含量/（μg/kg）；CO為內標化合物質量濃度/（μg/μL）；VO為內標化合物進樣體積/μL；SX為未知揮發性化合物的峰面積/（AU·min）；SO為添加的內標化合物峰面積/（AU·min）；m為試樣的質量/kg。

1.3.9 電子鼻傳感器檢測[17]

準確量取3 g臘肉瘦肉部分，25 ℃恒溫環境平衡30 min，運用PEN3型電子鼻傳感器對不同樣品進行檢測。傳感信號在60 s后基本穩定，選定信號采集時間為70 s，每種樣品分別做5 次平行重復。

1.4 數據處理與統計分析

所有的測定項目均取自瘦肉部分，Microsoft Excel 2010統計分析數據計算標準差；差異性分析用SPSS軟件進行數據分析，采用單因素方差Duncan法分析，P小于0.05為差異顯著；電子鼻數據分析運用PEN3型電子鼻配套的Winmuster 軟件Version 3.0對兩組樣品中第70秒采集時間的數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）[17]。

2 結果與分析

2.1 葡萄球菌發酵劑對臘肉成品中理化特性的影響

表3 葡萄球菌組和空白組臘肉理化指標的變化Table 3 Physicochemical parameters of dry-cured meat made with and without starter culture

水分活度為0.85以下時，一般細菌和酵母菌基本都不能生長[4-5]。由表3可知，兩組成品的水分質量分數、水分活度和pH值差異不顯著，表明添加葡萄球菌混合發酵劑對產品的水分質量分數、水分活度和pH值基本沒有影響。葡萄球菌添加組成品的水分質量分數為41.54%、水分活度為0.813、pH 5.69，基本符合臘肉的貯藏要求。

脂肪的分解和氧化在腌臘制品加工成熟后期的貯藏過程中始終存在，過度氧化會產生酸敗和腐臭，影響產品風味。酸價是脂肪中游離脂肪酸含量的標志，可作為脂肪水解程度的指標。由表3可知，葡萄球菌添加組中酸價顯著高于空白組，這與已有的報道[32]一致。過氧化值主要是用來評價脂質氧化形成初級氧化產物——脂質氫過氧化物的量。硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acidreactive substance，TBARS）含量主要用來評價脂質二次氧化程度，主要反映了脂質氧化形成的以丙二醛為代表的化合物含量，因此這兩個指標常被作為評價食品氧化變質程度的指標。GB 2730—2015《腌臘肉制品》[1]中規定臘肉的過氧化值不大于0.50 g/100 g。Wood等[34]認為當肉品中的TBARS含量超過0.5 mg/kg，肉品就會出現酸敗味。由表3可知，兩組產品均達到國標的衛生要求，但葡萄球菌組中過氧化值和TBARS含量顯著低于空白組（P＜0.05）。

葡萄球菌添加組的酸價高于空白組，說明添加的發酵劑T-SC-200可更快地促進脂肪的分解。而過氧化值和TBARS含量低于空白組，這可能由于木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑具有抗氧化能力，其在發酵過程中可產抗氧化酶，如過氧化氫酶為過氧化物清除酶，可分解氫過氧化物生成水[35]，抑制其進一步的氧化，因此添加組中脂肪氧化程度顯著低于空白組。Chen Qian等[36]也得到相似的結果。

蛋白質水解程度可用蛋白質降解指數表示，蛋白質水解程度太弱，造成產品香味、滋味等較弱，而蛋白質水解過度，產品的味道出現發苦、發酸的現象，嚴重影響產品品質。由表3可知，與空白組相比，實驗組的蛋白質降解指數極顯著提高了17.89%（P＜0.01），這與葡萄球菌可分泌蛋白酶，從而酶促進了蛋白質的水解有關[27]。

如表3所示，明度值（L*）和黃度值（b*）在兩組中差異不顯著，而葡萄球菌添加組的a*顯著高于空白組，a*值越大，紅色越鮮艷，發色效果越好。表明添加木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌發酵劑對臘肉的發色起到了一定的協助效果。這可能因為發酵劑中的葡萄球菌代謝產生的硝酸還原酶可將亞硝酸鹽還原產生NO，NO再與肌紅蛋白結合形成亞硝肌紅蛋白，或是直接轉化高鐵肌紅蛋白產生具有紅色色澤的肌紅蛋白衍生物[37-38]。

2.2 葡萄球菌添加組和空白組臘肉成品中微生物分析

圖1 添加組和空白組中不同微生物菌落總數的對比Fig. 1 Comparison of total microbial colonies in the inoculated group and the blank group

從圖1可明顯看出，由于接種了復合發酵劑T-SC-200，接種組臘肉成品中葡萄球菌的菌數達到7.3 （lg（CFU/g）），顯著高于空白組（5.8（lg（CFU/g）））（P＜0.05）。其他微生物如乳酸菌、大腸桿菌和菌落總數差異不顯著。即使原料肉經過紫外照射降低其初始菌落數，但加工過程中環境以及輔料中微生物的帶入，使兩組臘肉成品中的乳酸菌數達到107左右的數量級，接近接種組中臘肉成品中的葡萄球菌數，這是由于環境中存在大量的乳酸菌，且其存活力和繁殖能力強，這與已有的研究發現四川臘肉的優勢菌為乳酸菌和葡萄球菌[39]相一致。

2.3 添加葡萄球菌組臘肉和空白組成品感官分析

表4 感官評價結果Table 4 Results of sensory analysis

由表4可知，兩組在口感方面差異不顯著，在色澤、氣味和整體接受度方面，發酵劑添加組的色澤更加鮮亮，香味更加濃郁，整體接受度達到9.15 分，評價結果要顯著優于空白組（P＜0.05）。說明添加葡萄球菌發酵劑通過發酵使產品的品質得到了提高。

2.4 葡萄球菌發酵劑對臘肉成品中揮發性風味物質以及香氣物質的影響

臘肉風味物質來源于脂肪、蛋白質、碳水化合物在臘肉生產過程中所發生的一系列物理生化變化，還與生產所用的原輔料、生產工藝、生產參數等條件密切相關[32]。為研究葡萄球菌發酵劑對揮發性風味物質生成途徑的影響，將其揮發性風味物質按照其可能來源分為氨基酸代謝、糖類發酵、微生物酯化和輔料白酒、脂質氧化和其他未知來源物質，結果見表5和圖2。經氣相色譜-質譜分析，兩組臘肉成品中揮發性風味物質共鑒定出57 種，葡萄球菌組中51 種，比空白組（44 種）的數量多7 種，說明葡萄球菌發酵劑可促進揮發性風味物質種類的增加。由圖2可知，葡萄球菌組中氨基酸代謝、糖類發酵和微生物酯化所產的揮發性風味物質的種量和總含量均比空白組高，而脂肪氧化源風味物質的總量顯著低于空白組；由此說明，添加葡萄球菌發酵劑對促進氨基酸代謝源風味物質的形成具有良好的效果，同時可以延緩脂肪氧化源風味物質的生成速率。

但大部分揮發性化合物沒有香氣特征，僅有13 種香氣化合物由嗅聞檢測器檢測到，其中包括氨基酸代謝源（3-甲基丁醛、苯乙醛、3-甲基丁酸）3 類，微生物酯化和輔料白酒物質（乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯）5 類，脂質氧化（己醛、庚醛、壬醛、2-庚醇、1-辛烯-3-醇）5 種，還有一種質譜未能檢測到但香氣強烈未知物，構成了臘肉的整體香氣。與空白組相比，葡萄球菌添加組特有的香氣化合物是3-甲基丁醛（巧克力、麥芽香）、3-甲基丁酸（酸、臭）、2-甲基丁酸乙酯（水果香）、己酸乙酯（窖香、水果香）4 種；其顯著增加了樣品中3-甲基丁酸乙酯（甜香、脂香）化合物的含量，還顯著降低了己醛（青草味）、壬醛（脂肪、植物、綠草）這兩種脂肪氧化源風味物質的含量。有研究表明，葡萄球菌代謝支鏈氨基酸生成相應的醇、醛、酸，如3-甲基丁醇來源于亮氨酸[40]。

表5 葡萄球菌添加組和空白組臘肉成品中香氣風味物質的對比結果Table 5 Quantitative and qualitative comparison of aroma compounds in the inoculated group and the blank group

續表5

圖2 葡萄球菌組和空白組臘肉中不同可能來源的揮發性風味物質總量Fig. 2 Comparison of contents of volatile compounds from different sources in the inoculated group and the blank group

2.5 電子鼻分析

圖3 葡萄球菌添加組和空白組臘肉成品中PCAFig. 3 PCA analysis of volatile fl avor compounds in the inoculated group and the blank group

如圖3所示，PCA中各組分析數據點均分布在各自的區域內，沒有重疊現象，PC1、PC2的方差貢獻率分別為89.04%和8.9%，總貢獻率達97.94%，表明2個主成分基本代表了樣品的信息，由此說明添加葡萄球菌發酵劑的臘肉樣品的風味變化明顯。

3 結 論

本實驗通過添加木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑制作臘肉，研究其對產品理化、微生物、感官特性和香氣化合物的影響。發現葡萄球菌發酵劑對成品的水分含量、水分活度、pH值沒有顯著影響。與空白組比，葡萄球菌發酵劑可顯著提高產品的酸價、蛋白質降解指數、紅度值a*、香氣和接受度得分及氨基酸代謝源風味化合物的種類和含量（3-甲基丁醛、3-甲基丁酸），顯著降低了過氧化值、TBARS含量和脂肪氧化源風味化合物的含量（己醛、壬醛）。電子鼻傳感器能夠將2 組產品區分開，說明加入發酵劑后，臘肉的風味有所改變。因此，通過添加葡萄球菌發酵劑可以促進蛋白質和脂肪的水解、改善臘肉的色澤，促進風味快速形成，同時延緩脂肪氧化，最終顯著影響產品的品質。通過添加葡萄球菌發酵劑改進工業化臘肉的生產工藝是切實可行，既可以縮短產品的生產周期，又提高產品品質，滿足工業化臘肉的加工要求。