苯丙酮尿癥的實(shí)驗(yàn)室診斷與防治措施

植瑞東 何夏怡 寧紅珠

(廣東省肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 526020)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria， PKU)是一種以智力發(fā)育不全為主要特征的常染色體隱性遺傳病，由肝臟苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase， PAH)或四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)合成酶缺乏導(dǎo)致苯丙氨酸(phenylalanine， Phe)代謝異常所致。前者稱為經(jīng)典型PKU，后者則稱為BH4缺乏癥。PKU在我國(guó)的群體發(fā)病率約為1/11144[1]。1953年德國(guó)的Bickel首先報(bào)道了用低苯丙氨酸方法治療PKU獲得成功，1963年Guthrie開(kāi)展了新生兒篩查法，1983年Woo等[2]首先發(fā)現(xiàn)了PAH基因，開(kāi)啟了PKU的基因診斷和產(chǎn)前診斷。PKU是可治性的遺傳病，通過(guò)及時(shí)診斷并采取有效的防治措施，可使PKU患兒保持正常的生理和智力發(fā)育，對(duì)改善患者的臨床癥狀、減輕患者的痛苦及患者家庭的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)意義重大。

1 PKU的發(fā)病機(jī)制與臨床表現(xiàn)

1.1 經(jīng)典型PKU的發(fā)病機(jī)制與臨床表現(xiàn) 經(jīng)典型PKU是由于PAH基因突變導(dǎo)致肝臟PAH缺乏或活性降低所致。正常情況下，人體內(nèi)的Phe主要通過(guò)PAH的催化作用而被轉(zhuǎn)變成酪氨酸，繼而生成黑色素。如果PAH缺乏或活性降低，可使Phe轉(zhuǎn)化成酪氨酸的代謝受阻，造成Phe在血中過(guò)量積累。過(guò)量的Phe使旁路代謝活躍，進(jìn)而生成大量的苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸等產(chǎn)物，這些旁路代謝產(chǎn)物可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆的毒性作用，從而使患兒在出生3個(gè)月后逐漸表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、智力缺陷、語(yǔ)言障礙、小腦畸形和癲癇等癥狀[3]。血中過(guò)量的Phe可由尿液和汗液排出，使患兒的毛發(fā)、皮膚和尿液均有特殊的鼠臭氣味。同時(shí)，由于Phe不能正常轉(zhuǎn)化成酪氨酸，減少了黑色素的合成，使患者的毛發(fā)和皮膚顏色變淺。經(jīng)典型PKU的發(fā)病率占PKU的98%～99%，患者血中Phe濃度>20mg/dL，而正常人血中Phe的濃度<2mg/dL。

1.2 BH4缺乏癥的發(fā)病機(jī)制與臨床表現(xiàn) BH4缺乏癥又稱非經(jīng)典型PKU或惡性PKU，由PAH輔酶BH4缺乏所致。PAH主要存在于肝臟，它的作用需要輔助因子BH4， BH4缺乏可影響PAH的穩(wěn)定性，從而使其活性降低，使Phe轉(zhuǎn)化成酪氨酸的代謝受阻，導(dǎo)致血中Phe濃度升高，出現(xiàn)類似于經(jīng)典型PKU的代謝異常。

另外，在正常情況下PAH催化Phe轉(zhuǎn)化為酪氨酸時(shí)，BH4也轉(zhuǎn)化為二氫生物蝶呤(BH2)，后者在BH2還原酶催化下還原生成BH4。因此BH2還原酶缺乏時(shí)也會(huì)引起B(yǎng)H4缺乏，而導(dǎo)致Phe不能轉(zhuǎn)化為酪氨酸，致使Phe在體內(nèi)積累。由于BH4也是酪氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的輔助因子，因此當(dāng)BH4缺乏時(shí)，亦可影響酪氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的穩(wěn)定性，從而使其活性降低，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)左旋多巴和5-羥色氨酸的生成受阻，進(jìn)而影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和5-羥色胺的生成，致使患者出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，其后果比經(jīng)典型PKU更為嚴(yán)重，且預(yù)后更差。BH4缺乏癥的發(fā)病率占PKU的1%～2%，其類型包括GTP環(huán)羥化酶(GTPCH)缺乏癥、6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)缺乏癥、二氫生物蝶啶還原酶(DHPR)缺乏癥和蝶呤-4a-甲醇胺脫水酶(PCT)缺乏癥等類型。患者除有經(jīng)典型PKU的臨床表現(xiàn)外，還有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如軀干肌張力下降、四肢張力增高、不自主運(yùn)動(dòng)、震顫、頑固性驚厥發(fā)作等[4]。

2 苯丙酮尿癥的實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 血液苯丙氨酸濃度檢測(cè) 檢測(cè)方法很多，主要介紹其中的三種。

2.1.1 Guthrie細(xì)菌抑制試驗(yàn)法 本法是篩查PKU的常規(guī)方法，其基本原理為枯草桿菌的生長(zhǎng)需要Phe，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入與Phe結(jié)構(gòu)相似的抑制劑(β-2-噻吩丙氨酸)時(shí)，枯草桿菌的生長(zhǎng)便受到抑制。若在此培養(yǎng)基中加入Phe，抑制劑的抑制作用即被解除，枯草桿菌又可重新生長(zhǎng)。根據(jù)此原理，將PKU患者的待測(cè)樣本(濾紙血片)放于含有抑制劑的培養(yǎng)基上，樣本中的Phe便滲透到培養(yǎng)基內(nèi)，被抑制的枯草桿菌即可重新生長(zhǎng)，便在樣本的周圍長(zhǎng)出明顯的菌環(huán)，菌環(huán)的大小與樣本中的Phe含量成正比。通過(guò)比較菌環(huán)的大小，便可測(cè)定血中Phe的含量。

2.1.2 化學(xué)熒光檢測(cè)法 化學(xué)熒光法是衛(wèi)生部推薦的實(shí)驗(yàn)方法之一，其實(shí)驗(yàn)原理是利用Phe能與茚三酮試劑反應(yīng)生成熒光復(fù)合物，再加入增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑增強(qiáng)熒光后，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，即可測(cè)定新生兒血中的Phe含量，熒光強(qiáng)度與Phe含量成正比。

2.1.3 高效液相色譜法 不同待測(cè)物與高效液相色譜柱的固定相之間的分配系數(shù)、親和力和吸附力不同，當(dāng)它們隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱移動(dòng)時(shí)會(huì)因其分配系數(shù)等因素不同而被分離，并按一定順序離開(kāi)固定相進(jìn)入檢測(cè)器內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)器的檢測(cè)分析便可定量測(cè)定待測(cè)物的濃度。高效液相色譜法除可單獨(dú)測(cè)定新生兒血中的Phe含量外，還可同時(shí)測(cè)定樣本中的酪氨酸(Tyr)濃度，臨床上推薦應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定血中的Phe和Tyr濃度，然后根據(jù)Phe與Tyr的比值來(lái)進(jìn)行新生兒PKU的診斷篩查(Phe/Tyr值小于1.0時(shí)為正常，反之為PKU患者)，可有效提高PKU患兒的檢出率。高效液相色譜法具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是PKU篩查診斷和治療監(jiān)測(cè)的良好檢測(cè)方法[5]。

除上述方法外，臨床上用于測(cè)定Phe濃度的方法還有酶定量檢測(cè)法(苯丙氨酸脫氫酶定量檢測(cè)法、苯丙氨酸裂解酶定量檢測(cè)法和苯丙氨酸脫氨酶定量檢測(cè)法)、質(zhì)譜檢測(cè)法和高效毛細(xì)管電泳法等，不一一贅述。

2.2 尿液代謝物分析檢測(cè) 主要有尿蝶呤圖譜分析和檢測(cè)尿中苯丙酮酸的化學(xué)顯色法。

2.2.1 尿蝶呤圖譜分析 應(yīng)用高效液相層析法測(cè)定尿液中的新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)的含量，可用于各型PKU的鑒別診斷。典型PKU患兒尿中蝶呤總量增高，N/B比值正常；PTPS缺陷所致的BH4缺乏癥患兒尿中新蝶呤明顯增加，生物蝶呤下降，N/B比值增高；DHPR缺乏癥的患兒尿中新蝶呤可正常或稍高，生物蝶呤明顯增加，N/B比值降低；CTPCH缺乏癥的患兒尿中新蝶呤、生物蝶呤均降低，N/B比值正常。

2.2.2 尿三氯化鐵試驗(yàn)和2，4-二硝基苯肼試驗(yàn) 兩者均是檢測(cè)尿中苯丙酮酸的化學(xué)顯色法，一般用于較大嬰兒或兒童的篩查。其原理為將三氯化鐵滴入尿液中，若出現(xiàn)綠色反應(yīng)則為陽(yáng)性，表明尿中苯丙酮酸濃度增高。同理，在尿液中滴入2，4-二硝基苯肼后出現(xiàn)黃色沉淀反應(yīng)則為陽(yáng)性。

2.3 基因診斷 PAH基因定位于12q23.2[6]，98%以上的PKU都是由于PAH基因突變導(dǎo)致肝臟PAH缺陷引起。截至2014年，PAH基因國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)(www.pahdb.mcgill.ca)收錄了752種突變，在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)的PAH基因突變有100余種[7]。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)這些突變基因進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)與分析，是開(kāi)展PKU基因診斷和產(chǎn)前診斷、降低PKU患兒出生率和提高人口素質(zhì)的重要手段，對(duì)于近親結(jié)婚、家庭成員中曾有過(guò)PKU患者或曾生育過(guò)PKU患者的夫婦來(lái)說(shuō)尤其重要。

2.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)-短串聯(lián)重復(fù)序列(PCR-STR)連鎖分析 在PAH基因3號(hào)內(nèi)含子中(距外顯子3700bp處)有一順序?yàn)?TCTA)n的四核苷酸短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，此序列具有高度的多態(tài)性，PCR擴(kuò)增后的長(zhǎng)度為228～260bp，可用于PKU的家系連鎖分析[8]。PCR-STR分析法是經(jīng)典型PKU基因診斷和產(chǎn)前診斷的一種簡(jiǎn)便、有效的方法。

2.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析 單鏈的DNA片斷具有復(fù)雜的空間構(gòu)象，當(dāng)某一堿基發(fā)生改變時(shí)，便會(huì)由于鏈內(nèi)堿基對(duì)或分子內(nèi)的相互作用力改變而形成不同的構(gòu)象，這種構(gòu)象的變化將造成相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率不同，在進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它們就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)速度的差異。通過(guò)電泳圖譜的差異進(jìn)行PAH基因分析，即可對(duì)胎兒或新生兒的PKU進(jìn)行診斷。

2.3.3 多重等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MAS-PCR) 根據(jù)N/C引物和M/C引物的MAS-PCR結(jié)果，可直接判斷被檢基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變。如果只有正常引物N/C的擴(kuò)增，說(shuō)明該基因位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生突變；如果只有突變引物M/C擴(kuò)增，則為基因突變純合子；正常引物和突變引物均有擴(kuò)增，則為基因突變雜合子。臨床上可用這一檢測(cè)方法進(jìn)行PKU的診斷。

除此之外，臨床上應(yīng)用于PAH基因檢測(cè)的方法還有聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析法、聚合酶鏈反應(yīng)-溫度梯度凝膠電泳(PCR-TGGE)分析法和基因芯片分析法等。

3 苯丙酮尿癥的防治

3.1 苯丙酮尿癥的防治原則 PKU是一種可以早期篩查和治療的常染色體隱性遺傳病，其防治原則為： ①開(kāi)展PKU新生兒篩查，早發(fā)現(xiàn)，早治療。PKU新生兒篩查可在嬰兒出生后2周內(nèi)進(jìn)行，一旦確診，應(yīng)及早給予積極治療。治療的年齡愈小，預(yù)后愈好，其智力發(fā)育更接近正常人，而較晚治療可造成不同程度的智力低下。②推薦應(yīng)用低苯丙氨酸飲食療法。由于Phe是人體內(nèi)合成蛋白質(zhì)的必需氨基酸，完全缺乏時(shí)亦可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害，因此在低苯丙氨酸飲食治療中需嚴(yán)格控制Phe的攝入量，一般保持血中Phe濃度在2～6mg/dL較為理想。低苯丙氨酸飲食控制至少持續(xù)到青春期以后。③女性患者應(yīng)于孕前開(kāi)始進(jìn)行低Phe飲食至分娩，以免高苯丙氨酸血癥影響胎兒發(fā)育。④避免親近結(jié)婚。⑤高危家庭必須采用基因診斷技術(shù)對(duì)其胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以降低PKU患兒的出生率。

3.2 苯丙酮尿癥的治療措施 主要包括飲食控制和藥物治療。

3.2.1 低苯丙氨酸飲食控制 主要用于經(jīng)典型PKU患兒的治療。天然食物和母乳均含一定量的苯丙氨酸，因此一旦確診，患者就應(yīng)立即停止天然飲食，哺乳期嬰兒應(yīng)暫停母乳喂養(yǎng)，給予低苯丙氨酸奶方治療，以保證患者正常的生長(zhǎng)發(fā)育。低苯丙氨酸飲食可推薦使用國(guó)產(chǎn)低苯丙氨酸奶方華夏2號(hào)，治療中按其治療劑量服用，并于治療第一周內(nèi)每天采血測(cè)定Phe濃度，至治療第4d左右使患兒血中Phe濃度降至10mg/dL以下。待血Phe濃度降到理想濃度(0～3歲，2～4mg/dL；3～9歲，3～6mg/dL；9～12歲，3～8mg/dL；12～16歲，3～10mg/dL；大于16歲，3～15mg/dL)時(shí)，可逐漸少量添加天然飲食，其中嬰兒首選母乳，較大嬰兒及兒童可添加牛奶、粥、面和蛋等輔食。添加食品應(yīng)以低蛋白、低苯丙氨酸為原則，其食量、次數(shù)隨血Phe濃度而定。為監(jiān)控患兒的Phe濃度，務(wù)必于更換食譜后3d復(fù)查Phe濃度。

3.2.2 BH4、5-羥色胺和美多巴藥物治療 主要用于BH4缺乏癥患兒的治療。BH4缺乏癥患兒采用低苯丙氨酸飲食治療，雖能降低血Phe濃度，但不能改善因BH4缺乏導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)生成障礙而出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，因此必須給予BH4、5-羥色胺和美多巴等神經(jīng)遞質(zhì)前質(zhì)，以維持腦和神經(jīng)肌肉的正常發(fā)育。

低苯丙氨酸飲食療法是目前治療PKU較為有效的方法，但因低苯丙氨酸產(chǎn)品的味道較差，往往導(dǎo)致患者的依從性降低，同時(shí)影響患者的生活質(zhì)量。因此當(dāng)患者難以繼續(xù)堅(jiān)持本飲食療法時(shí)，應(yīng)采取其他的治療方法，如高劑量蛋白質(zhì)替代療法、酶替代療法、大分子中性氨基酸攝入法或基因療法等繼續(xù)治療，以達(dá)到理想的治療效果。