菊花離體快繁技術流程概述

蘇云鳳 岳中輝

(1 哈爾濱師范大學教師教育學院 150025； 2 哈爾濱師范大學生命科學與技術學院 150025)

菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物，是世界四大切花之一，已成為全世界普遍栽培的重要花卉。菊花除了具有很高的觀賞價值外，還具有清熱解毒、平肝明目等藥用價值。菊花主要靠扦插或嫁接繁殖，需較多的母株材料，且受季節和外界環境的限制，繁殖速度較慢。而離體快繁是指利用離體培養技術，將植物的器官、組織或是細胞在合適的條件下用培養基進行培養，在短期內獲得大量遺傳性一致的個體的方法。對菊花進行離體快繁，可以提高菊花的繁殖系數和繁殖速度，滿足菊花種苗的市場需求。本文綜述菊花離體快繁的技術流程，為菊花及其他園藝植物的離體快繁研究提供基礎資料。

1 菊花離體快繁技術的流程

1.1 外植體的選擇 在進行菊花離體快繁時，首先要進行外植體的選擇，目前人們采用的外植體有莖尖、莖段、葉片、花瓣、花蕾、花序軸以及花托等。其中最常采用的是幼嫩的帶芽莖段，其次是幼嫩的莖尖和花瓣。這些外植體可以來自自然生長的健壯植株，也可以源自離體條件下由種子培養出的無菌苗。外植體選擇好后，需要對外植體進行適當的修剪。

1.2 外植體的滅菌 將修剪后的外植體在超凈工作臺上進行滅菌，常用的滅菌劑是酒精+升汞，即先用70%～75%酒精處理30s，再用0.1%的升汞處理5～20min。當外植體是莖尖、莖段、葉片、花蕾時滅菌時間為5～8min，外植體是花瓣、花序軸、花托時滅菌時間為10～20min。也有學者用酒精+次氯酸鈉來滅菌，即先用75%酒精對未開放花蕾進行表面滅菌15s，再用次氯酸鈉處理5min(外植體是花瓣)。此外，可用次氯酸鈉和戊二醛作為滅菌劑，對花蕾進行滅菌。

1.3 外植體的接種 若外植體是莖尖或莖段，可將其剪成1～2cm大小，基部切成斜切面，插于培養基上完成接種；當外植體是葉片、花瓣時，可將其切成0.5cm×0.5cm大小的小片，按照形態學方向平鋪接種；若外植體是花蕾，需要將其縱切成大小相等的3～6塊，平放著接種于培養基中；若外植體是花序軸或花托時，則需要把其切成4等塊，并將表面向上進行接種。

1.4 外植體的誘導培養 菊花外植體接種后開始進行人工誘導培養，培養溫度控制在24～26℃，濕度控制在65%～85%，光照時間10～12h/d，光照強度為1000lx～3000lx。培養時多以MS為基本培養基，加入細胞分裂素(6-BA、KT)和生長素(NAA、IBA、2,4-D、IBA)兩類植物生長調節劑，細胞分裂素的濃度一般為1.0～2.0mg/L，生長素的濃度一般為0.1mg/L。若外植體為莖尖或莖段時，可誘導外植體直接成芽，加入的植物生長調節劑一般是6-BA和NAA；若外植體為葉和花時，需要先誘導形成愈傷組織然后成芽，加入的植物生長調節劑是6-BA或KT和NAA或IBA或2,4-D等。

1.5 芽的增殖培養 在外植體誘導成芽后，需要進行繼代培養進行芽的增殖。一般也是以MS培養基，加入6-BA和NAA， 6-BA的濃度一般為1.0～2.0mg/L， NAA的濃度一般為0.1mg/L。

1.6 試管苗的生根培養 增殖后的試管苗長到2cm高以上時，即可轉接至生根培養基上進行生根培養。大多數研究是用1/2 MS作為基本培養基，再向培養基中加入NAA， NAA的濃度一般為0.1～0.2mg/L，也有學者加入IBA進行生根培養，IBA的濃度一般為0.5mg/L。

1.7 煉苗和移栽 當生根培養中的根長到3～4cm、平均根數2～3條以上時，即可進行煉苗。煉苗時首先將瓶塞打開，讓其由無菌環境轉至有菌且濕度較低的環境中鍛煉3d，此時苗的成活率最高，可達95%以上。然后將苗取出，洗凈根部附著的培養基，移栽到基質中。基質分為有機基質和無機基質，有機基質主要有壤土、泥炭土、沙土、草炭、椰糠、腐熟的豬糞等；無機基質主要有蛭石、珍珠巖、沙等。移栽時兩種基質常搭配使用，最常用的是壤土+珍珠巖。

2 菊花離體快繁中的幾個技術問題

2.1 外植體的處理 對外植體需要進行5個方面的處理： ①外植體的清理： 在取得外植體后，需要將其在燒杯中用飽和洗衣粉溶液漂洗或洗潔精水浸泡10～15min，再用蒸餾水沖洗20～30min，去掉表面泥土和雜質，防止其污染外植體；②外植體的修剪： 對外植體進行滅菌前，不要把莖上的嫩葉剝得太干凈，以免傷口面暴露太大，導致外植體的損傷，從而影響培養效果；③外植體的滅菌： 用升汞滅菌外植體時，若處理時間過長，外植體污染率雖低，但死亡率增高，若時間過短則污染率增高，研究發現以升汞處理5min效果最好，滅菌成活率達77.8%。但升汞含有劇毒，且對環境污染嚴重，因此在外植體滅菌時應盡量減少升汞的使用或用其他的滅菌劑代替；④外植體的接種： 在進行外植體的接種時，需將外植體接觸滅菌液的切口切去一小段，可減少滅菌藥物對外植體的毒害。

2.2 培養基的參數選擇 涉及2個方面的問題： ①pH值調節： pH值對培養基的凝固度有較大影響，一般培養基的pH在5.6～5.8，pH過高培養基變硬，過低培養基不能凝固；②植物生長調節劑配比： 植物生長調節劑主要分為生長素和細胞分裂素，兩者的配比影響植物組織脫分化的方向。當生長素與細胞分裂素比例適中，且生長素含量高于細胞分裂素時，主要誘導形成愈傷組織和根原基；當細胞分裂素含量高于生長素時，主要誘導形成芽原基。

2.3 試管苗的成活率 由于試管苗一直處于人工控制的適宜環境，其抗病和抗干旱等能力均較弱，一旦出瓶種植，幼苗的成活率將受到影響，所以移栽初期的管理是移栽成功的關鍵。由于根系供水緩慢，剛移栽的幼苗要避免強光照射和增加葉表面濕度。但長時間的高濕度利于繁殖猝倒病菌，幼苗最易感染細菌、病毒，引起成活率下降，因此煉苗時間不宜過長。選擇3d作為煉苗時間較合適，在移栽2d后要適當增加光照和減少濕度。

2.4 試管苗的褐化及玻璃化 在誘導愈傷過程中，由于材料基因型、生理狀況和培養條件等因素影響，外植體會發生不同程度的褐化，嚴重影響愈傷分化誘導、再生芽形成。除此之外，在菊花組織培養過程中，還可能會產生玻璃化的叢生芽。有研究發現，AgNO3可防止培養物的褐化與玻璃化。

3 展望

菊花的離體快繁技術日趨完善，已初步建立了一套菊花組培快繁的培養程序，但該技術成本較高，所以如何通過簡化培養基、簡化工序以及改進移栽技術等方法來降低成本，生產出大量廉價的優良植株，是菊花離體快繁技術亟待解決的問題。