IL-1β及其受體在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表達定位

王靖雷，王 萌，潘陽陽，李 秦，何翃閎，黃玉風， 趙 凌，樊江峰，崔 燕，余四九

(甘肅農業大學 動物醫學院/甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070)

細胞因子最初被認定為免疫細胞分泌的肽和蛋白產物，在胚胎發育的子宮內膜生理和母體調控中發揮著重要作用[1-2]。在哺乳動物中，細胞因子表達失調可能會導致植入和胎盤形成異常[3]。白細胞介素-1(IL-1)是一種主要的促炎性細胞因子，在脊椎動物的母-嬰交流界面局部調節子宮內膜許多生理功能[4]。 IL-1系統由2種激動劑(IL-1α，IL-1β)，拮抗劑(IL-1受體拮抗劑，IL-1RN)和受體家族組成。 IL-1受體家族由I型( IL1R1)和II型(IL1R2)IL-1受體和IL1R輔助蛋白(IL1RAP)[5]組成。 IL-1α(IL1A)和 IL-1β(IL1B)都能與 IL1R1和IL1R2結合，而IL1RAP不能識別配體，但能增加白細胞介素的受體親和力[6]。只有IL1R1轉導信號應答IL-1，而IL1R2通過競爭IL-1結合來抑制IL-1的活性[7]。IL-1系統在人[8]、小鼠[9]、牛子宮內膜和子宮液[10-11]均有表達,同時在人類、小鼠、豬、牛胚胎中以及豬的子宮液中均檢測到IL-1β[12-13]。受體IL1R1在人、鼠[12]、豬[14]和牛子宮內膜[15]和植入前人和小鼠胚胎中均存在[13,16]。來自不同物種的植入前胚胎產生并應答IL-1[12,17-21]。在人上，植入前胚胎在培養過程中釋放IL-1β進入培養基[22-23]，表明IL-1β分泌可以預測胚胎發育的潛能，且可作為懷孕的評價指標。表明IL-1β和 IL1R1在多種哺乳動物的生殖過程具有重要生物學作用，但相關機制還在進一步研究中，且存在一定的物種特異性。

牦牛(Bos grunniens)為生活在高寒低氧地區的珍稀高原物種[24]，是世界上罕見的物種資源之一。與其他家畜相比，牦牛繁殖性能差，且很少應用生物技術[25]。因此，牦牛作為高寒低氧環境哺乳動物生理特性研究的典型，研究 IL-1β和 IL1R1參與牦牛生殖生理調控對高寒低氧環境哺乳動物輔助繁殖技術的提高具有重要意義。

胚胎體外培養的質量取決與培養基和培養條件，多種因子協同可促進胚胎發育[26]。在牛上，授精后8～10 h添加 IL1β可提高胚胎發育到囊胚期的比例[27]，但 IL1β對哺乳動物胚胎發育的調控作用是否存在物種特異性仍需證實。因此，本研究檢測 IL-1β和 IL1R1在牦牛發情周期各生殖系統的表達和分布，并分析其在胚胎發育過程中的表達水平，旨在將胚胎發育和生殖器官有效結合，闡明 IL-1β和 IL1R1在牦牛生殖生理調控中的潛在作用，為進一步研究 IL-1β和 IL1R1對牦牛胚胎發育的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TCM-199、D-PBS、離子霉素(Ion)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)購自Sigma公司。胎牛血清(FBS)購自Thermo Fisher Scientific公司；G1/G2聯合培養液購自Vitrolife公司；SOFaa培養液為國產分析純試劑配制；組織和胚胎RNA提取試劑盒購自Omega公司；兩步法反轉錄試劑盒購自Promega公司，SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，蛋白質免疫印跡(Western blot，WB)所用試劑均購自南京碧云天公司，其他試劑均為國產分析純。免疫組織化學染色試劑盒(包括A 液：10%非免疫動物血清；B 液：山羊抗家兔 IgG；C液：辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素液)、Rabbit Anti-IL-1Beta、Rabbit Anti-IL-1R1、Goat Anti-rabbit IgG/HRP均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 樣品收集

1.2.1 組織樣品采集 2017 年 9 月在青海省西寧市樂家灣屠宰場采集樣品。挑選卵泡期、黃體期和妊娠期健康母牦牛各3 頭(各繁殖生理階段分別處于同一時期，年齡接近)，頸動脈放血致死解剖后迅速采集卵泡期后期(有優勢卵泡>6 mm，子宮黏液和彈性)、黃體期后期(可見多個黃體)同側的卵巢、輸卵管和子宮，及妊娠期早期(胚胎約長 2.3 cm)妊娠側的卵巢、輸卵管、子宮和胎盤，無菌生理鹽水對其沖洗干凈并修剪后，用錫箔紙將其包裹放入預先標記好的布袋中，速投入液氮中帶回實驗室，存于―80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。另一部分組織樣品切成小塊后用4%(質量分數)多聚甲醛溶液固定帶回實驗室，4 ℃保存備用。

1.2.2 牦牛卵母細胞的采集及體外培養 牦牛卵母細胞體外成熟：從青海省西寧市樂家灣屠宰場采集發情期牦牛的卵巢，將采集的卵巢置于約35 ℃含雙抗(青霉素和鏈霉素)的生理鹽水中，4 h 內帶回實驗室，將帶回實驗室的牦牛卵巢用加入鏈霉素與青霉素的37 ℃生理鹽水沖洗3次，用10 mL注射器將每個卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液抽取到盛有采卵液[D-PBS+5%(質量分數)FBS]的10 mL離心管中混勻；然后，將采卵液倒入培養皿中，置于體視顯微鏡下，采卵針將采到的卵母細胞放入盛有采卵液的培養皿中清洗3次；再放入成熟培養液[TCM-199+10%(質量分數)FBS+100 μg/mL FSH+50 μg/mL LH+100 μg/mL E2+100 μg/mL青霉素+100 μg/mL 鏈霉素]中，在37 ℃ 5%(體積分數)CO2和飽和濕度下培養，24 h后以卵母細胞周圍出現卵丘細胞并伴有第一極體的出現作為成熟標志。

牦牛卵母細胞孤雌激活：將成熟后的卵母細胞用D-PBS清洗3次后，移入1 g/L的透明質酸酶液體中反復輕微吹打幾分鐘，使其脫去周圍的顆粒細胞。然后，在含有胎牛血清的D-PBS中清洗3次。挑選成熟的卵母細胞，將其轉移到離子霉素(5 μmol)微滴液中激活5 min。然后，在基礎培養液(TCM199)中清洗3次。再將其移入6-DMAP(2 mmol)微滴液中4 h，完成激活。將激活后的卵母細胞放入含1% BSA的SoFaa培養液中(每100 μL的微滴含有20個卵母細胞)，在37 ℃ 5%(體積分數)CO2和飽和濕度下培養，分別在48、72、96、120、144和168 h時收集不同時期的胚胎，包括2～4細胞、8細胞、桑椹胚和囊胚。

1.3 qRT-PCR檢測IL-1β和IL1R1 mRNA在組織和胚胎中的表達

1.3.1 總RNA提取 分別參照Total RNA KitⅠ(Omega，美國)和MicroElute Total RNA Kit(Omega，美國)RNA提取試劑盒說明，提取不同時期雌牦牛主要生殖器官和胚胎的總RNA，并參照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。

1.3.2 qRT-PCR 根據GenBank公布的牛的 IL1-β和 IL1R1 mRNA序列設計引物，其具體信息和反應條件見表1。反應體系為1 μL cDNA(500 ng/μL)，上下游引物各1 μL(0.2 μmol/mL)，2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL，Passive Reference DyeⅡ 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，總反應體系為20 μL。具體反應條件：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性10 s、退火10 s(具體溫度見表1)、72 ℃延伸10 s，共40個循環，所用實時熒光定量PCR儀為applied biosystems QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System。內參基因為GAPDH，重復次數n=3。根據熔解曲線判斷反應特異性，獲得每個樣品的Ct(cycle threshold，循環閾值)值，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Information of primers used in qRT-PCR

1.4 Western-blot檢測IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的表達

1.4.1 蛋白質樣品制備 取不同時期牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織樣品各0.1 g，分別加入等量的組織均質緩沖液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)，冰浴振蕩2 h，然后4 ℃ 12 000 g離心5 min，取上清液，并取90 μL，加30 μL溴酚藍混勻，100 ℃煮10 min，后冰上冷卻5 min，制成變性蛋白，-20 ℃保存，備用。

1.4.2 Western-blot檢測 先進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE) 電泳， 5%濃縮膠(體積分數)和10%(體積分數)分離膠；電泳結束后根據目的蛋白大小對照Marker 條帶切膠，選擇濕法將凝膠上的蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上；用磷酸緩沖鹽溶液-吐溫(PBS+tween 20, PBST)洗 3 次，每次 10 min；用5%(質量分數)脫脂奶粉置于搖床上室溫封閉95 min；分別加一抗(1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，取出后用 PBST 洗 3 次，每次10 min；加二抗(1∶1 000稀釋)于搖床上室溫孵育90 min；用 PBST洗3次，每次 10 min；最后用電化學發光(electro-chemi-luminescence, ECL)避光顯色，X 光片顯影、定影，掃描蛋白印跡條帶。每組蛋白重復3次，Image J軟件分析掃描的蛋白印跡條帶，根據測得的灰度值分析蛋白表達情況(蛋白表達量=目的灰度數值/內參灰度數值)。

1.5 免疫組織化學檢測 IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的分布

組織固定完全后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm。切片常規脫蠟至水，在 pH=6的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中進行熱誘導的微波抗原修復，煮沸 5 min，然后維持 8 min，室溫下自然冷卻；滴加φ=3% H2O2(SP 試劑盒)，37 ℃作用 10 min，用以阻斷內源性過氧化物酶活性；滴加封閉液(SP 試劑盒A 液)，37 ℃濕盒孵育 15 min，勿洗只需吸去多余血清，用以減少非特異性背景；滴加一抗(1∶400 稀釋)，37 ℃濕盒孵育 2 h，陰性對照用 0.02 mol/L PBS 代替一抗；滴加生物素標記的二抗(SP試劑盒B 液)，37 ℃下孵育 15 min；滴加 SP 試劑盒中 C 液，濕盒中 37 ℃下孵育15 min；加DAB 顯色液(Invitrogen Zymed，美國)，進行免疫組織化學顯色。蘇木精復染、梯度酒精脫水、透明、封片，晾干后置于顯微鏡(DP71，Olympus，日本)下拍照。

1.6 數據分析

采用SPSS 19.0對 IL-1β、 IL1R1基因與蛋白的相對表達量進行單因素方差分析，每組至少重復3次，P<0.05表示差異顯著，所有結果以“平均值±標準誤”表示。用Graphpad prism 7繪圖。

2 結果與分析

2.1 IL-1β和IL1R1 mRNA在組織和胚胎中的表達

經擴增效率曲線、熔解曲線分析 IL-1β、 IL1R1及內參基因GAPDH分別在81.5、84.6和84.2 ℃出現單一產物峰，均與設計的引物預期產物溫度接近，證明引物擴增正常特異性良好。

通過qRT-PCR結果分析發現 IL-1β和 IL1R1基因在雌牦牛卵泡期、黃體期和妊娠期中的輸卵管、卵巢和子宮中均有表達(圖1)。其中，卵泡期輸卵管 IL-1β和 IL1R1基因的相對表達量均顯著高于其他2期(圖1-A、圖1-D)。卵泡期和妊娠期卵巢 IL-1β和 IL1R1基因的相對表達量均顯著高于黃體期(圖1-B和圖1-E)。卵泡期和妊娠期子宮 IL-1β基因的相對表達量均顯著高于黃體期(圖1-C)，卵泡期、妊娠期子宮 IL1R1基因的相對表達量顯著高于黃體期(圖1-F)。表明 IL-1β和 IL1R1在不同時期雌性牦牛主要生殖器官中存在表達差異。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letter mean significantly different(P<0.05)，the same below

qRT-PCR結果顯示(圖2) IL-1β和 IL1R1在胚胎發育過程中，2～4細胞、8細胞、桑椹胚和囊胚中均有表達。其中8細胞和桑椹胚時期 IL-1β基因的相對表達量均顯著高于2～4細胞和囊胚時期(圖2-A)。桑椹胚時期 IL1R1基因的相對表達量均顯著高于2～4細胞、8細胞和囊胚期(圖2-B)。結果表明 IL-1β和 IL1R1基因在孤雌激活胚胎早期發育過程中存在表達差異。

2.2 IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的表達

Western-blot曝光圖掃描結果顯示(圖3)，IL-1β、IL1R1和β-actin蛋白在雌牦牛卵泡期、黃體期和妊娠期的輸卵管、卵巢和子宮中均有表達。且蛋白大小與抗體參考說明一致，β-actin為 42 ku，IL1R1為 63 ku，IL-1β為30 ku和17 ku。

Western-blot結果分析顯示，卵泡期輸卵管和卵巢17 ku IL-1β蛋白表達顯著高于黃體期和妊娠期(圖4-A和圖4-B)。妊娠期子宮17 ku IL-1β蛋白表達顯著高于其他2期(圖4-C)。

Western-blot結果分析顯示，卵泡期輸卵管和卵巢30 ku IL-1β蛋白表達顯著高于黃體期和妊娠期(圖5-A和圖5-B)。妊娠期子宮30 ku IL-1β蛋白表達顯著高于其他2期(圖5-C)。

圖2 IL-1β和 IL1R1在不同時期胚胎中的相對表達水平Fig.2 Relative expression level of IL-1β and IL1R1 at different embryonic stages

1～3.卵泡期輸卵管、卵巢、子宮 Fallopian tubes, ovaries and uterus in follicular phase；4～6.黃體期輸卵管、卵巢、子宮 Fallopian tubes, ovaries and uterus in luteal phase；7～9.妊娠期輸卵管、卵巢、子宮 Fallopian tubes, ovaries and uterus in pregnancy

Western-blot結果分析顯示，黃體期輸卵管IL1R1蛋白表達顯著高于卵泡期和妊娠期(圖6-A)。卵泡期卵巢IL1R1蛋白表達顯著高于黃體期和妊娠期(圖6-B)。妊娠期子宮IL1R1蛋白表達顯著高于卵泡期和黃體期(圖6-C)。

2.3 IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的分布

免疫組織化學染色可見陽性產物呈棕褐色，表示有該蛋白的分布。免疫組織化學試驗結果顯示(圖7)，IL-1β和IL1R1蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期的輸卵管、卵巢和子宮組織切片中均有陽性表達。輸卵管表達部位為黏膜上皮，卵巢表達部位為顆粒層和黃體細胞，子宮表達部位為子宮內膜和子宮腺，IL-1β和IL1R1分布部位相同。

3 討 論

本研究發現，IL-1β和 IL1R1在卵泡期、黃體期、妊娠期的輸卵管、卵巢、子宮和體外培養的孤雌激活胚胎中均有表達，證明在正常生理條件下 IL-1β和 IL1R1廣泛表達于母牦牛不同繁殖周期的各個主要生殖器官中。

3.1 IL-1β和 IL1R1在輸卵管中的表達

卵泡期輸卵管中 IL-1β和 IL1R1基因表達均高于黃體期與妊娠期，按照牦牛繁殖周期劃分順序卵泡期、黃體期、妊娠期中 IL-1β和 IL1R1基因表達依次遞減，推測可能與輸卵管的生理活動有關，卵泡期卵巢產生的雌激素增加，引起輸卵管內膜細胞和微絨毛增長，輸卵管活動增強。IL-1β蛋白與基因表達基本一致，而 IL1R1基因與蛋白表達不一致，IL1R1的差異表達可能是通過局部反調節機制來緩和和緩沖IL1的過度效應[28]。免疫組化結果顯示IL-1β和 IL1R1表達于輸卵管粘膜上皮細胞，粘膜上皮細胞具有分泌功能，報道稱輸卵管分泌的活性物質為胚胎早期發育提供了一個維持和增強受精的環境[29-30]， IL-1β和 IL1R1在輸卵管中的表達結果與前人研究一致[31]IL-1系統在輸卵管中的表達具有持續性，并且輸卵管中IL-1的表達可能在早期胚胎植入過程中胚胎-母體間的相互作用中發揮著至關重要的作用，因此推測 IL-1β和IL1R1在牦牛輸卵管中的表達也具有此作用。

圖4 IL-1β蛋白(17 ku)在不同組織中的相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of IL-1β(17 ku)protein in different tissues

圖5 IL-1β蛋白(30 ku)在不同組織中的相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of IL-1β(30 ku)protein in different tissues

3.2 IL-1β和IL1R1在卵巢中的表達

卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中 IL-1β和 IL1R1表達高于黃體期，免疫組化結果顯示IL-1β和IL1R1在卵泡顆粒細胞胞質、妊娠期黃體細胞有表達。卵泡期卵巢受FSH的影響卵泡明顯增長，并且產生的雌激素增加，排卵和分泌各種激素為受精做準備。妊娠期卵巢上一直存在黃體維持妊娠，并且會有卵泡發育，卵巢生理活動增強。卵巢具有眾多功能，包括提供能受精的卵母細胞和分泌生殖激素以及維持雌性動物發情周期。卵巢功能直接影響著雌性動物的繁殖能力[32]。每個發情周期過程中，卵巢都會經歷增殖、侵襲、分化和細胞凋亡；這些正常的生理變化直接影響和決定了雌性動物的排卵、受精率和產仔數[33]。前人研究發現IL-1能夠誘導排卵。在大鼠中，IL-1通過提高卵母細胞的排卵率來增強LH的誘發性排卵效果[34-35]。并且這一發現在母馬上得到證實[36]。相反，使用IL1R1[37]、卵巢注射[38]或卵泡內注射時能降低排卵率或延遲排卵排卵時間。這些研究已經證實IL-1參與排卵，并且這種效應是由特異性受體介導的。綜上所述， IL-1β和 IL1R1在牦牛卵巢的表達可能與牦牛卵母細胞的成熟、排卵和早期胚胎發育有關。

圖6 IL1R1蛋白(63 ku)在不同組織中的相對表達水平Fig.6 Relative expression levels of IL1R1(63 ku)protein in different tissues

3.3 IL-1β和IL1R1在子宮中的表達

妊娠期子宮中 IL-1β和 IL1R1基因和蛋白的表達均高于卵泡期和黃體期。免疫組化結果顯示 IL-1β和 IL1R1在子宮上皮細胞及子宮腺中表達。子宮作為動物胎兒或幼體發育生長的場所，在整個動物繁殖過程中扮演著重要的角色，整個妊娠期中子宮為胎兒提供發育的環境，并且提供胎兒發育所需的各種營養物質。本研究中IL-1β和 IL1R1在子宮上皮細胞及子宮腺中分布這與前人報道 IL1R1在妊娠前期豬子宮腺上皮細胞中[12,39]和牛子宮內膜中檢測到[15]一致。IL-1β強表達于牛子宮內膜，在基質中較弱[40]并且推測IL-1β可能在牛子宮內膜中以旁分泌/自分泌的方式起作用，這種結果在豬上也有發現[41]。前人報道IL1系統可能參與胚胎在牛[11]和豬子宮環境中胚胎營養狀況的改善[42]。因此推測 IL-1β和 IL1R1在牦牛子宮中的表達也可能參與妊娠的建立及胎兒的發育，相關機制有待進一步探究。

3.4 IL-1β和IL1R1在孤雌激活胚胎中的表達

牦牛孤雌激活胚胎中 IL-1β在桑椹胚時期最高，8細胞次之，而在2細胞和囊胚時期最低， IL1R1表達結果與 IL-1β基本一致。在2細胞時期表達最低可能與母源物質的影響有關，隨著胚胎的發育，母源物質逐漸下降，胚胎基因組激活后，轉錄表達開始，胚胎的發育逐漸由自身合成的物質來調控，其代謝活動逐步由母源的mRNA向合子本身的mRNA控制過度，這一過程即使發育由母源向胚胎調控轉變[43]。本研究發現 IL-1β在8細胞有較高分泌水平，與前人報道在人和豬上 IL-1β由植入前囊胚分泌[19]的結果不一致，可能是由于物種差異。相關報道稱胚胎培養基中的IL1濃度與體外受精和胚胎移植后成功植入呈正相關[22,25]與早期妊娠有相關性。

A～I.免疫組織化學染色圖片 A-I are immunohistochemical staining photos；其中A、B、C、D、E為陽性表達 A,B,C,D,E are positive expression，F、G、H、I為陰性對照 G,H,I are negative control；A、F為輸卵管 Fallopian tube，B、E、G為卵巢 Ovary，C、D、H、I為子宮 Uterus；EM：黏膜上皮 Mucosal epithelium；SG.顆粒層 Stratum granulosum；EP.子宮內膜 Epithelium mucosae；UG.子宮腺 Uterine glands；CL.黃體細胞 Corpus luteum verum

4 結 論

本試驗在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中對 IL-1β和 IL1R1的表達進行定位分析。研究發現 IL-1β和 IL1R1在雌性牦牛不同時期的生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表達并且存在差異，表明 IL-1β和 IL1R1在牦牛生殖過程中具有重要的生物學作用，推測其可能參與牦牛卵母細胞成熟、排卵、早期胚胎和妊娠期胎兒的發育，相關機制有待進一步研究。