Semaphorin 3A 早期診斷對比劑急性腎損傷的價值

張藝欣， 寧 莉， 魏殿軍

（1.天津醫院輸血科，天津 300211；2.天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津 300211；3.河北燕達醫院檢驗科，河北 廊坊 065201）

對比劑急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CIAKI）是指血管內應用對比劑后3 d內出現急性腎損傷或原有腎損傷加劇，并排除其他原因導致的腎功能障礙[1]。CIAKI是心臟冠狀動脈造影和經皮冠狀動脈介入治療的常見并發癥。隨著血管造影、增強電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、心臟血管再通技術等一系列現代影像技術和介入治療的不斷應用和發展，CIAKI發生率也呈逐年上升的趨勢，現居醫院獲得性急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）病因的第3位[1]?；颊咭坏┏霈FCIAKI，其病死率及預后不良、終末期腎病的發生率將顯著增加，同時住院時間也明顯延長。因此，CIAKI的早期診斷對改善患者預后極為重要。近年來，多種具有臨床應用潛力的AKI標志性蛋白逐漸被發現，如中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）、胱抑素C（cystatin C，Cys C）、腎損傷分子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）、白細胞介素18（interleukin 18，IL-18）等，但這些指標在輔助臨床診斷及指導疾病治療方面尚不成熟。因此，臨床為實現CIAKI的早期發現、早期診斷和早期干預，迫切需要尋找早期的、具有較高敏感性和特異性的生物學標志物。

Semaphorin（Sema）3A是Semaphorins家族中的一種分泌型蛋白，與調節免疫功能、腫瘤發生及發展、器官形成具有密切關系[2]。Sema 3A在成年人腎臟的遠曲小管上皮細胞中表達[3]，過度分泌可導致腎小球內皮細胞損傷和基底膜分層，從而引起腎臟損傷[4]。近期有研究結果顯示，Sema 3A在正常成人尿中通常檢測不到，但在AKI發生后可快速檢出，因此Sema 3A可作為AKI的早期預測指標[5]。目前，Sema 3A對CIAKI的臨床診斷價值報道甚少，國內尚無這方面的研究。本研究通過檢測成人冠狀動脈造影及支架植入術后并發CIAKI的患者外周血和尿液Sema 3A水平以及β2-MG、Cys C、血清肌酐（serum creatinine，SCr）早期的變化，分析Sema 3A與早期CIAKI之間的關系，尋找CIAKI最理想的早期生物學標志物。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年6月—2016年6月天津醫科大學第二醫院心臟內科行冠狀動脈造影及支架植入術患者350例，其中男220例、女130例，年齡31～84歲。記錄患者的年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、SCr、β2-MG、Cys C的手術前基礎值，是否合并高血壓或糖尿病以及冠狀動脈造影及介入手術后的住院時間、是否透析和發生死亡等情況。

CIAKI的診斷標準參照歐洲泌尿生殖放射協會（European Society of Urogenital Radiology，ESUR）2003年制定的標準[6]：與基線值相比，接觸對比劑后72 h內SCr相對值升高25%或絕對值升高44.2 μmol/L（0.5 mg/dL），并除外其他可能的原因。所有患者術前腎功能均正常，基礎肌酐清除率＞100 mL/（min·1.73 m2）（采用Schwartz公式計算）。為減少術后循環損耗和腎前氮質血癥的影響，所有受試者應在第1次手術后24 h內補充損耗液體的80%，直至100%。根據CIAKI診斷標準將350例患者分為CIAKI組46例、非CIAKI組304例。

排除標準：碘過敏者、急慢性感染者、近期發生急性腎功能衰竭者、SCr＞300 μmol/L的慢性腎功能不全者、處于血液透析治療中的患者、惡性腫瘤患者、最近1周接受過造影劑檢查以及順應性差者、之前服用過腎臟毒性藥物和尿液收集不完整者。

1.2 樣本采集與檢測

收集所有患者術前及術后6、12、24、48、72 h的血液和尿液樣本。采用促凝劑/分離膠黃帽真空采血管一次性抽取患者血液3～5 mL，以1 260×g離心5 min，分離血清，儲存于-20 ℃冰箱。留取患者中段清潔尿10 mL，以560×g離心5 min，取上清分裝。檢測前將樣本恢復至室溫，完全融化、復溫、混合均勻。

1.3 儀器與試劑

NORMAN系列散射比濁分析儀（南京諾爾曼生物技術有限公司）、BS2000M全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。β2-MG及Cr試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，Cys C試劑盒購自北京九強生物技術股份有限公司。Sema 3A試劑盒購自天津信睿生物科技有限公司。

1.4 血清、尿液Sema 3A水平檢測

采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測患者血清和尿液Sema 3A水平。嚴格按試劑說明書操作。為排除尿液稀釋對Sema 3A水平的影響，采用尿液肌酐（urinary creatinine，UCr）矯正Sema 3A檢測結果，最終結果以Sema 3A/UCr比值表示，單位為pg/μmol Cr。ELISA試劑盒的最低檢出率為0.57 ng/ mL，檢測范圍為1.563～100.000 ng/mL，變異系數為6.8 %。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以表示。2個組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA分析。呈非正態分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項目診斷CIAKI的價值。采用Spearman相關分析評估不同時間點的尿液Sema 3A水平與臨床表現（SCr百分比變化、手術后住院時間和AKI持續時間）的相關性。采用Logistic回歸分析評估AKI的預測因子，潛在獨立預測變量包括最佳檢出時間的尿液Sema 3A水平、年齡、性別、心臟手術和住院時間。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般臨床資料比較

350例患者中有46例患者術后發生CIAKI，發生率為13.1%。住院期間CIAKI組發生死亡1例（男性）。CIAKI組性別比例、糖尿病和住院時間與非CIAKI組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其他項目差異均無統計學意義（P＞0.05）?；颊咭话闱闆r見表1。

2.2 CIAKI患者血清SCr、β2-MG、Cys C水平及血清、尿液Sema 3A水平的變化

與術前基礎值比較，CIAKI組SCr、β2-MG、Cys C、血清Sema 3A水平均有不同程度的升高（P＜0.05），于術后48 h達到最高值。CIAKI組24和48 h的SCr、β2-MG、Cys C、血清Sema 3A水平明顯高于非CIAKI組（P＜0.05）。CIAKI組尿液Sema 3A在手術后6 h明顯升高（P＜0.05），而術后12 h后則明顯降低（P＜0.05）。非CIAKI組尿液Sema 3A僅有短暫、較小幅度的升高，手術12 h后保持在基線水平。見表2～表 6、圖1。

表1 研究對象一般臨床資料比較

表2 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清SCr的變化 （μmol/L，）

表2 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清SCr的變化 （μmol/L，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術前基礎值比較，#P＜0.05

組別 例數 術前基礎值 術后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 53.11±10.30 56.88±12.45 58.71±11.63 68.11±13.24*# 72.53±12.10*#67.11±11.04*#非CIAKI組 304 57.22±11.90 54.62±10.01 56.35±12.11 54.16±10.58 55.54±12.42 50.90±11.21

表3 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清β2-MG的變化 （mg/L，）

表3 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清β2-MG的變化 （mg/L，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術前基礎值比較，#P＜0.05；與同組術后6 h比較，△P＜0.05；與同組術后12 h比較，▲P＜0.05

組別 例數 術前基礎值 術后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 1.59±0.71 1.52±0.68 1.62±0.87 1.82±0.74*# 2.13±0.50*#△▲ 1.55±0.62非CIAKI組 304 1.54±0.74 1.51±0.63 1.55±0.44 1.49±0.74 1.49±0.85 1.50±0.76

表4 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清Cys C的變化 （mg/L，）

表4 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清Cys C的變化 （mg/L，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術前基礎值比較，#P＜0.05

組別 例數 術前基礎值 術后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 0.53±0.35 0.51±0.41 0.51±0.37 0.75±0.32*# 0.83±0.19*# 0.76±0.21*#非CIAKI組 304 0.57±0.51 0.56±0.23 0.49±0.31 0.58±0.45 0.54±0.11 0.57±0.33

表5 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后血清Sema 3A的變化 [ng/mL，M（P25～P75）]

表6 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后尿液Sema A的變化 （pg/μmol Cr，）

表6 CIAKI組和非CIAKI組術前及術后尿液Sema A的變化 （pg/μmol Cr，）

注：與非CIAKI組比較，*P＜0.05；與同組術前基礎值比較，#P＜0.05

組別 例數 術前基礎值 術后6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CIAKI組 46 35.0±5.1 293.8±25.3*# 158.2±17.3*# 67.8±6.6*# 56.5±5.9 46.0±4.5非CIAKI組 304 34.8±4.3 51.9±6.5 33.9±4.5 27.1±2.4 27.9±2.3 30.2±2.5

圖1 心臟造影術后患者血清、尿液Sema 3A變化

2.3 尿液Sema 3A與CIAKI的相關性分析

單因素Logistic回歸分析顯示男性（P=0.023 0）、住院時間較長（P=0.000 7）及術后6 h（P=0.002 5）、12 h（P=0.003 8）、24 h（P=0.008 6）的高尿Sema 3A水平與CIAKI發病相關。進一步行逐步Logistic回歸分析，以年齡、性別、住院時間、尿Sema 3A最佳檢測時間點（術后6 h）為變量預測CIAKI，隊列模型顯示性別、術后6 h 尿Sema 3A水平是獨立預測CIAKI的指標。

對尿液Sema 3A與CIAKI患者臨床指標進行相關性分析，術前尿液Sema 3A水平與年齡、術后SCr變化和AKI持續時間呈負相關（P＜0.05）。術后6 h和12 h的高尿液Sema 3A水平與SCr升高及住院時間、AKI持續時間延長明顯相關（P＜0.01）。而尿液Sema 3A水平與手術后48 h年齡、術后SCr變化、住院時間、AKI持續時間無相關性。見表7。

表7 尿液Sema 3A與臨床指標的相關性分析

2.4 尿液Sema 3A與各項指標診斷CIAKI的性能評價

ROC曲線分析顯示，SCr、β2-MG、Cys C術后48 h診斷CIAKI的AUC[95%可信區間（confidence interval，CI）]分別為0.821（0.542～0.963）、0.750（0.454～0.901）、0.839（0.593～0.965）。確定3種生物標志物的最佳診斷時間點為術后48 h，其中Cys C診斷性能最佳。

繪制尿液Sema 3A診斷CIAKI的ROC曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。6、12 h尿液Sema 3A的AUC分別為0.856（P＜0.000 1）和0.732（P=0.000 9），高于β2-MG、Cys C、SCr的AUC。尿液Sema 3A 24 h時的診斷性能稍低于血清Sema 3A。比較各時間點不同標志物的AUC和P值的預測模型，結果顯示術后6 h的尿液Sema 3A的診斷性能最佳。

患者術后血清SCr、β2-MG、Cys C及血清、尿液Sema 3A的診斷性能見表8。術后尿液Sema 3A的ROC曲線分析見圖2。

表8 Sema 3A、SCr、β2-MG、Cys C診斷CIAKI的性能比較

續表8

圖2 術后6 h、12 h尿液Sema 3A診斷CIAKI的ROC曲線

進一步評價術后6 h尿液Sema 3A診斷CIAKI的最佳臨界值，比較120、245、428 pg/μmol Cr 3個不同水平的診斷性能，結果顯示當術后6 h尿液Sema 3A為245 pg/μmol Cr時診斷性能最優，此時敏感性為84%，特異性為92%，陽性預測值為91%，陰性預測值為87%。見表9。

表9 尿液Sema3A術后6 h診斷性能評價

3 討論

CIAKI可導致急性腎衰竭，延長了患者的住院時間，增加了不良事件及終末期腎病的發生率。因此，實現對CIAKI的早期診斷，從而控制疾病的發生發展、改善患者預后已成為臨床亟待解決的問題。CIAKI的發病機制十分復雜，還未被完全闡明。目前認為，對比劑引起的腎臟血流動力學變化[7-8]和對比劑的直接腎小管毒性[6]是CIAKI的主要發病機制。Sema 3A是抗血管生成因子，與細胞遷移相關。在生理條件下，通過Sema 3A的受體神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，Nrp-1）、血管內皮生長因子受體2和整合素β3的相互作用來維持基底膜的完整性；當Sema 3A表達增加時，與Nrp-1結合增加，激活叢狀蛋白-A1受體，從而影響毛細血管袢和腎小球基底膜的形成[4]。Sema 3A可在腎臟發育和成年人腎臟遠曲小管上皮細胞中被檢測到[7]，且在特定刺激下會分泌到尿液中，表明Sema 3A在腎臟損傷中發揮重要作用[9]。腎損傷時Sema 3A有可能參與了腎小管上皮細胞的增殖和遷移。有研究結果顯示，Sema 3A在腎臟發育和損傷中具有重要作用，可通過調控足細胞分化來影響腎小球發育[10]。在藥物刺激或缺氧條件下，Sema 3A自腎遠曲小管上皮細胞分泌至尿液中[11]，引起短暫的大量蛋白尿，導致血管內皮細胞損傷。本研究結果顯示，冠狀動脈造影后數小時Sema 3A水平明顯升高，很容易從尿液中檢出。CIAKI患者血清、尿液Sema 3A水平在術后6 h達到最高，而血清β2-MG、Cys C、SCr則在術后48～72 h才升高，Sema 3A峰值的出現遠早于其他AKI標志蛋白。由此可見，腎損傷時尿液Sema 3A可在短時間內升高，可作為早期診斷CIAKI的生物標志物。ROC曲線分析顯示，術后6 h尿液Sema 3A診斷CIAKI的性能最佳，最佳臨界值為245 pg/μmol Cr，敏感性為84%，特異性為92%，陽性預測值為91%，陰性預測值為87%。Logistic回歸分析顯示性別、術后6 h Sema 3A水平是獨立預測CIAKI的指標。

綜上所述，本研究結果證實Sema 3A可作為CIAKI的早期生物標志物，對CIAKI具有早期診斷價值，可以幫助臨床盡早對CIAKI患者實施干預，對降低醫療費用和患者死亡率具有重要的價值。