木香烴內酯對肺癌細胞A549的凋亡作用及其機制*

羅 雪，彭建明，江秀玲（揚州市職業大學醫學院，江蘇 225009）

木香烴內酯是從中藥木香、月桂樹、荷花、玉蘭等植物中提取的主要化學成分，具有多種藥理學和生物化學活性[1]。研究表明，木香烴內酯可降低血糖，能抑制機體對酒精的吸收，有抗炎、抑制微生物活性和抗腫瘤等多種藥理學功能[2?4]。然而關于木香烴內酯在肺癌中作用的報道較少見。本研究以人非小細胞肺癌A549細胞為模型，分析了木香烴內酯對肺癌細胞的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。木香烴內酯購自上海詩丹德生物公司，純度大于98%，用二甲基亞砜（DMSO）配置成200 mmol/L備用；胎牛血清和DMEM培養基均為美國Gibco公司產品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自AMRESO公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒為上海碧云天生物技術公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，放于37℃、5%二氧化碳細胞培養箱中進行培養。以下各實驗部分所用細胞均為對數生長期的細胞。

1.2.2 細胞體外生長 取對數生長期的細胞，將細胞濃度調整為5×104mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板中，加入不同濃度的木香烴內酯（3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 和 100.000 μmol/L），分別為 a、b、c、d、e、f組，對照組加入0.1%DMSO，48 h后采用MTT法測定腫瘤細胞活性。每孔加入10 μL MTT，混勻后在37℃溫度下培養4 h，然后吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，使用酶標儀測定在492 nm處的吸光度值（OD）。抑制率=（1-各劑量組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3 細胞凋亡比例 細胞與不同濃度藥物孵育48h后，收集細胞并用 10 μg/mL Annexin V?FITC 和 20 μg/mL PI進行染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

1.2.4 Bax mRNA和Bcl?2表達 細胞經木香烴內酯處理后，用Trizol法提取總RNA，反轉錄為第一鏈互補DNA（cDNA），然后以cDNA為模板，采用反轉錄?聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定細胞內Bax和Bcl?2基因表達情況。內參基因為甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH），引物如下：Bcl?2 上游引物為 5′?GGT CGC CAG GAC CTC GCC GC?3′，下游引物為 5′?AGT CGT CGC CGG CCT GGC G?3′；Bax 上游引物為 5′?GAG CTG CAG AGG ATG ATT GC?3′，下游引物為 5′?AGC CCA ACA GCC GCT CCC GG?3′；GAPDH 上游引物為 5′?GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT?3′，下游引物為 5′?GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG?3′。

1.3 統計學處理 采用SPSS12.0軟件進行統計學處理，計量資料以表示，組間比較采用One?way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 木香烴內酯抗腫瘤細胞增殖 木香烴內酯對肺癌細胞A549的生長具有顯著抑制效果，木香烴內酯各劑量組與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），而且隨藥物劑量的不斷增加，其抑制效果更加顯著。見圖1。

圖1 木香烴內酯處理后對肺癌細胞A549增殖作用

2.2 木香烴內酯對肺癌細胞A549凋亡的影響 d、e、f組經木香烴內酯處理肺癌細胞A54948 h后，其凋亡率分別為（6.90±0.32）%、（28.07±0.22）%和（46.92±0.44）%，與對照組的（2.51±0.28）%比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。

2.3 木香烴內酯對肺癌細胞A549 Bax和Bcl?2基因表達作用 與對照組比較，d、e、f組經木香烴內酯組細胞內Bcl?2基因表達水平明顯下降，而Bax基因表達水平顯著升高，Bcl?2/Bax比值也明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3、4。

圖2 木香烴內酯處理后對A549細胞凋亡作用

圖3 木香烴內酯處理后對A549細胞基因表達作用

圖4 木香烴內酯處理后對A549細胞Bax/Bcl-2比率的影響

3 討 論

近年來，越來越多的科研工作者專注于抗癌中草藥的研發。研究表明，木香烴內酯具有比較廣泛的抗癌功能，對多種類型的惡性腫瘤如胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、白血病、肝癌和肺癌等都具有較好的抑制作用[4?7]。本文對木香烴內酯抗人非小細胞肺癌A549細胞的作用進行了研究，結果顯示，木香烴內酯能有效地抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖，并誘導其凋亡。

細胞凋亡又稱為程序性死亡，最初表示在機體發育過程中一種具有典型形態學特征的細胞死亡方式，多種病理學因素可以誘導細胞凋亡。細胞增殖和細胞凋亡的失衡在某些腫瘤的病理過程中起著非常重要的作用。凋亡的主要特征有細胞皺縮、膜翻轉、DNA梯狀條帶等[8?10]。細胞凋亡是一個主動由基因調控的生物學過程，因此能夠通過開發調控細胞凋亡相關蛋白的藥物來掌控細胞凋亡，Bcl?2家族蛋白便是其中的典型代表[11]。Bcl?2 家族主要分為兩類：抑制凋亡蛋白（如 Mcl?1和 Bcl?2 等）和誘導凋亡蛋白（如 Bax和 Bad 等）[12?13]。有研究顯示，Bcl?2蛋白能夠抑制線粒體膜間隙分子從線粒體釋放到細胞質，表明Bcl?2在線粒體凋亡通路中起了重要作用[12]。此外，Bcl?2還被發現能夠影響細胞內鈣內流。凋亡誘導信號能夠誘導鈣離子從內質網中釋放，線粒體中鈣離子過載后導致線粒體基質膨大，進而引起線粒體膜電位失勢，而Bcl?2能夠降低內質網中鈣離子的釋放，使細胞對凋亡不敏感，而Bax的作用則相反，能夠增加內質網中鈣離子的釋放[9，12?13]。本研究結果顯示，木香烴內酯通過抑制Bcl?2表達和促進Bax表達來誘導細胞凋亡，從而達到抑制肺癌細胞增殖的目的，提示Bcl?2和Bax參與木香烴內酯介導的肺癌細胞凋亡。有研究顯示，細胞凋亡過程中存在促凋亡蛋白Bax的增加和抑制凋亡蛋白 Bcl?2 的降低[8?10]。因此，Bcl?2/Bax 是細胞凋亡的重要指標之一。本研究結果顯示，經木香烴內酯處理后，肺癌細胞內Bcl?2/Bax比值顯著下降。

綜上所述，木香烴內酯能顯著抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖，并促進該細胞凋亡，其機制可能是通過降低Bcl?2表達，升高Bax表達，從而誘導該細胞發生凋亡。