響應曲面法優選香櫞配方顆粒揮發油包合工藝*

李雪利，高杰，李哲，常云鳳，孫福仁，高晗，李軍山，2（.神威藥業集團有限公司，河北石家莊05430；2.河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心，石家莊050200）

香櫞為蕓香科植物枸櫞或香圓的干燥成熟果實，在秋季果實成熟時采收，趁鮮切片，曬干或低溫干燥，亦可整個或對剖兩半后曬干或低溫干燥[1]，分布于江蘇、浙江、安徽、江西、湖北、四川等地，多為栽培。香櫞味辛、苦、酸，而性溫，歸脾、肝、肺經，化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎，具有疏肝理氣、寬中、化痰等功效，用于肝胃氣滯，胸脅脹痛，脘腹痞滿，嘔吐噫氣，痰多咳嗽。香櫞果實中含有多種成分，外層果皮含揮發油，揮發油中主要成分為枸櫞醛、苧烯、三萜烯等，另含橙皮苷[2]。目前，香櫞配方顆粒生產過程中揮發油為手工噴壺加入，該方法存在溶油耗時、加入不均勻及花粒等問題，同時中間產品儲存過程中及包裝后隨儲存時間的延長，揮發油會慢慢揮發而造成損失。為解決香櫞揮發油加油難及加入后的穩定性等問題，特展開香櫞揮發油β-環糊精（β-CD）包合工藝的探索研究。本研究采用響應曲面法，以揮發油包合率及包合物收率為考察指標，以揮發油與β-CD比例、包合溫度、包合時間為影響因素，確定香櫞配方顆粒揮發油包合工藝[3-6]，為工業化生產提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料 香櫞揮發油（批號：170922，神威藥業集團有限公司）、95%乙醇（分析純，批號：20170218，天津市申泰化學試劑有限公司）、β-CD（批號：160807，安徽山河藥用輔料股份有限公司）。

1.2 主要儀器 EMS-20磁力攪拌水浴鍋（金壇市儀都儀器有限公司）、CPA225D分析天平（賽多利斯）、JMA5002電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）、水循環真空泵（上海申生科技有限公司）、DHG-9140A熱風循環鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司、太倉精宏儀器設備有限公司）、LC-20AT高效液相色譜儀（島津儀器設備有限公司），KH3200E型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 香櫞配方顆粒揮發油的提取 取香櫞飲片150kg，加入7倍量的水，保持微沸狀態水蒸氣蒸餾，提取至揮發油不再流出，得到油水混合物；將得到的油水混合物放入4℃的冷藏庫內放置24 h，使油水自然分層，分離回收揮發油層，即得。

1.3.2 香櫞配方顆粒揮發油包合物的制備 （1）香櫞配方顆粒揮發油乙醇溶液的制備：取香櫞配方顆粒揮發油加入等量95%乙醇（V：V）進行溶解，混合均勻后備用。（2）β-CD飽和水溶液的制備：稱取各實驗方案中規定量的β-CD，加入處方量的純化水，在各方案規定的溫度下制成飽和水溶液，保溫，備用。（3）香櫞配方顆粒揮發油包合物的制備：將制備好的β-CD飽和水溶液置于EMS-20磁力攪拌水浴鍋內，按各實驗方案設定的包合條件進行包合，將香櫞配方顆粒揮發油乙醇溶液緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，待揮發油乙醇溶液全部加入后開始計時，繼續攪拌至規定時間，放至室溫，4℃冷藏24 h，抽濾，用無水乙醇20 mL洗滌3次，置熱風循環鼓風干燥箱內，45℃干燥5 h。

1.3.3 包合物收率及揮發油包合率的測定 （1）包合物中揮發油含量測定。按中國藥典2015版中揮發油測定法甲法，精密稱定上述香櫞揮發油的干燥包合物，置于燒瓶中，放入沸石適量，加水300 mL，振搖混合后，連接揮發油測定器與回流冷凝管，置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸至測定器中的油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端達到刻度0線上面5 mm處為止，放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰好與刻度0線平齊，讀取揮發油量，計算供試品中揮發油含量。（2）揮發油空白回收率測定。精密量取揮發油1.00 mL，β-CD 12 g，在與（1）相同條件下測定揮發油的體積，計算空白回收率。（3）β-CD與純化水比例的影響。稱取β-CD 5 份，各 15 g，分別加入 90、120、150、180、210 g純化水，置磁力攪拌水浴鍋內，40℃制成飽和水溶液，將香櫞配方顆粒揮發油1 mL與95%乙醇溶液1 mL混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，攪拌2 h，放冷，冰箱冷藏24 h，抽濾，用無水乙醇20 mL洗滌3次，45℃干燥5 h。（4）揮發油與β-CD比例的影響。同（3）稱取β-CD加入150 g純化水后制成飽和水溶液，分別將香櫞配方顆粒揮發油 2、1.5、1.2、1、0.75 mL 與等量 95% 乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中后同（3）處理。（5）包合時間的影響。同（3）稱取 β-CD 加入 150 g純化水后制成飽和水溶液，將香櫞配方顆粒揮發油1 mL與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，分別攪拌 1、2、3、4、5 h 后同（3）處理。（6）包合溫度的影響。稱取β-環糊精5份，各15 g，加入150 g純化水，置磁力攪拌水浴鍋內，分別于 30、40、50、60、70℃制成飽和水溶液，將香櫞配方顆粒揮發油1.5 g與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中后同（3）處理。

1.3.4 評價指標 以揮發油包合率和包合物收率的綜合評分為考察指標，兩個指標的權重為6：4，揮發油包合率=包合物實際含油量/揮發油空白回收率/投油量×100%，包合物收率=包合物重量/（β-CD重量+投油量）×100%，綜合評分=（揮發油包合率/揮發油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40[7-8]。

1.4 統計學處理 利用Design-Expert8.0.5軟件進行試驗設計，對綜合評分結果進行二次多元回歸擬合和方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 揮發油空白回收率測定結果 實驗3次，其值分別為90.00%、93.00%、92.00%，平均值為91.67%，相對標準偏差（RSD）為1.67%。

2.2 單因素考察試驗結果 測定揮發油包合率及包合物收率時，β-CD與純化水比例為1∶10時綜合評分最高，見圖1；揮發油與β-CD比例為1∶15綜合評分最高，見圖2；包合時間為4 h，綜合評分最高，見圖3；包合溫度為40℃時綜合評分最高，見圖4。

圖1 β-CD與純化水比例

圖2 揮發油與β-CD比例

2.3 香櫞配方顆粒揮發油包合工藝優選 在單因素試驗的基礎上，應用響應曲面法對香櫞配方顆粒揮發油的β-CD包合工藝進行優化。以揮發油與β-CD比例（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）為考察因素，每個因素選擇3個水平，響應曲面試驗因素水平編碼見表1。

2.4 響應曲面試驗結果分析 本試驗共含有17個試驗點，其中12個為析因點，5個為零點。Box-Behnken試驗設計及結果見表2，回歸模型和方差分析見表3。對綜合評分結果進行二次多元回歸擬合，回歸方程Y=95.78+7.20A-4.68B+2.21C-1.68AB-1.28AC-0.82BC-3.49A2-11.42B2-7.29C2，調整后相關系數為 0.9927，所建模型與試驗擬合較好。該模型具有顯著水平，足以擬合試驗數據，失擬項不顯著，說明試驗誤差小、可信度高，可以用于香櫞配方顆粒揮發油β-CD包合工藝的分析和預測。

圖3 包合時間的影響

圖4 包合溫度的影響

表1 響應曲面試驗因素水平編碼

2.5 各因素間相互作用對結果的影響 由方差分析結果可以看出，A、B交互效應顯著，A、C和B、C交互效應不顯著，等高線圖及效應曲面圖見圖5。從綜合評分考慮各個因素的影響程度大小為：A＞C＞B。

2.6 響應曲面優化香櫞配方顆粒揮發油β-CD包合工藝條件 最優干燥工藝為：揮發油與β-CD比例為1：16.23；包合溫度為39℃；包合時間為3.85 h。在此工藝條件下，綜合得分為98.104分。在優選出的最佳工藝條件下進行驗證試驗（n=3），得到包合物收率為75.64%，揮發油包合率為90.97%，綜合得分為97.36分，RSD為1.4%。實踐結果與模型預測值基本一致。

3 討 論

3.1 本研究通過單因素試驗和響應曲面分析對香櫞配方顆粒揮發油β-CD包合工藝進行優化，得到揮發油與β-CD比例、包合溫度、包合時間對包合物收率、揮發油包合率的回歸模型，經分析所建模型有效。該方法客觀合理的評價了香櫞配方顆粒揮發油β-CD包合過程，避免因主觀因素對試驗結果造成誤差，最終確定了最佳包合工藝。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 回歸模型和方差分析

3.2 由于揮發油性質不穩定、易揮散、具有刺激性、溶解性差，故成藥性差，將CD與揮發油包合后，可增加藥物的穩定性、減少揮發油的揮發、掩蓋不良氣味、增加揮發油的溶解度[9-14]，利于有效成分的穩定和保存[15-19]。因此，CD包合技術被廣泛用于揮發油的制劑過程。但目前CD與揮發油的包合研究應用于中藥配方顆粒尚未見報道。本研究對香櫞配方顆粒揮發油β-CD包合工藝進行了研究，打破中藥配方顆粒制備過程中揮發油傳統的加入方式，增強了藥物的穩定性及服藥適應性[20]。但改變揮發油加入方式對產品藥理作用產生的影響尚待進一步研究。

圖5 等高線和響應面圖