囊胚形成的影響因素及應用價值研究*

曹 芳，王宇峰，于春梅，夏西洋，戴秀亮，楊海燕（南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院生殖中心，江蘇213000）

胚胎質量是影響臨床治療結局的重要因素之一，將卵裂期胚胎繼續培養至囊胚階段，有利于進一步篩選出發育潛能好的胚胎，相較于卵裂胚，囊胚移植具有更高的種植率[1]。然而，體外環境不完全等同于體內環境，擴大培養后，可能使本來在體內可發育成囊胚的卵裂期胚胎停滯，降低囊胚形成率[2]。影響卵裂期胚胎繼續囊胚培養結局的因素是多方面的。不同中心之間因臨床促排卵方案、實驗室培養環境及胚胎和囊胚評分系統差異等原因，囊胚形成率有所不同[3]。本研究回顧性分析了不同質量第3天（D3）胚胎繼續培養后總囊胚形成率和優質囊胚形成率，并進一步分析了影響總囊胚形成比率及發育成囊胚速度的因素，探討D3非優質胚胎繼續培養囊胚的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1—8月在本中心行輔助生殖技術助孕的180對夫婦患者資料，共收集1009枚D3卵裂期冷凍后剩余胚胎，分為優質胚胎組（Ⅰ、Ⅱ級，664枚）及非優質胚胎組（Ⅲ級，345枚）。患者不孕原因包括輸卵管盆腔因素、子宮內膜異位癥等女方因素、雙方免疫因素、男方因素及不明原因不孕。

1.2 方法

1.2.1 囊胚培養 在序貫培養基（瑞典vitrolife公司）中培養至囊胚期，將D3胚胎從G1培養液移入平衡過夜的G2培養液中，于37℃、6%CO2環境中繼續培養至第6天（D6）。

1.2.2 胚胎評分 受精后D3觀察胚胎，按Peter卵裂期胚胎評分系統評估D3胚胎質量。Ⅰ級：卵裂球均勻，透亮，碎片率小于10%。Ⅱ級：卵裂球稍不均勻，碎片率為10%～20%。Ⅲ級：卵裂球形狀明顯不規則，細胞質中有顆粒現象，碎片率為20%～50%。Ⅰ級和Ⅱ級均為優質胚胎，Ⅲ級為非優質可用胚胎。

1.2.3 囊胚評分 按照Gamder囊胚評分法，根據囊胚擴張和孵化的程度將囊胚分成3～6級：3級為囊胚腔占據整個囊胚；4級為囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴大，透明帶變薄；5級為囊胚正在從透明帶破裂口中孵出；6級為囊胚完全從透明帶中脫出。3～6級囊胚還需對內細胞團（ICM）和滋養外胚層細胞（TE）進行評分。ICM評分：A級為細胞結合緊密，數目多；B級為細胞結合較松散，數目較少；C級為細胞數目極少。TE評分：A級為細胞數目多，結合緊密；B級為細胞數目較少，較松散；C級為細胞數目極少。本中心規定第5、6天（D5、D6）囊胚評分大于或等于4BB級的胚胎定為優質囊胚。

1.2.4 觀察指標 收集并分析患者年齡、不孕年限、體重指數（BMI）、基礎促卵泡素（FSH）水平、不孕原因、不孕類型、人絨毛膜促性腺激素（HCG）日雌二醇（E2）水平、用于囊胚培養的卵裂期胚胎質量及形成的囊胚數等資料。根據胚胎囊胚形成速度分為無囊胚形成亞組、完全D5形成囊胚亞組、完全D6形成囊胚亞組和D5+D6亞組，根據囊胚總形成情況分為A組（囊胚形成率小于或等于25%）、B組（囊胚形成率大于25%～＜50%）組和C組（囊胚形成率大于50%），比較不同發育速度的囊胚凍融周期的移植結局。囊胚形成率=形成的囊胚數/用于囊胚培養的胚胎數×100%。種植率=移植胚胎數/著床胚胎數×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS23.0軟件對基本資料及相關結局指標進行分析。計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組D3囊胚形成情況比較 經序貫培養，優質胚胎組形成503枚囊胚，囊胚形成率為75.75%，非優質胚胎組形成139個囊胚，囊胚形成率為40.29%，2組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。優質胚胎組 D5、D6、D5+D6亞組優質囊胚形成率高于非優質胚胎組，差異有統計學意義（P＜0.05）；優質胚胎組 D6、D5+D6亞組不可用囊胚形成率低于非優質胚胎組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

2.2 胚胎囊胚形成率的影響因素及種植率 與A組比較，B組、C組卵裂期優質胚胎構成比、標準長方案構成比、體外受精（IVF）構成比、HCG日E2水平較高，而拮抗劑方案構成比、卵細胞漿內單精子注射（ICSI）構成比較低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。3組胚胎種植率分別為 100.00%（1/1）、45.71%（16/35）、65.82%（104/158），其中C組胚胎種植率高于B組，差異有統計學意義（P＜0.01）。3組其余指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2、3。

表1 2組D3囊胚形成情況比較[n（%）]

表2 胚胎囊胚形成率的影響因素

表3 胚胎級別對胚胎囊胚形成率的影響[%（n/n）]

2.3 胚胎囊胚形成速度的影響因素及種植率 與無囊胚形成亞組比較，D5、D6、D5+D6亞組卵裂期優質胚胎構成比、HCG日E2水平較高，而卵裂期非優質胚胎構成比、排卵障礙因素較低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與無囊胚形成亞組比較，D6、D5+D6亞組標準長方案構成比較高，拮抗劑方案構成比較低，而D5亞組輸卵管因素構成比較高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。D5、D6、D5+D6亞組胚胎種植率分別為78.26%（18/23）、53.19%（25/47）、62.60%（77/123），其中 D5亞組胚胎種植率高于D6亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。4亞組其余指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4、5。

3 討 論

隨著體外受精?胚胎移植技術的發展，為提高不孕不育患者的胚胎利用率及累積妊娠率，非優質胚胎繼續囊胚培養成為移植冷凍后剩余非優質胚胎的主要處理對策[4]。本研究共收集1009個冷凍后剩余胚胎，經序貫培養，優質胚胎總囊胚形成率為75.75%，非優質胚胎的總囊胚形成率為40.29%。卵裂期優質胚胎組的優質囊胚形成率高于非優質胚胎組，不可用囊胚形成率低于非優質胚胎組。卵裂期胚胎質量不僅影響囊胚的形成率，也影響囊胚的質量。一項前瞻性研究發現，與發育至桑葚胚階段的胚胎比較，能發育至囊胚期的胚胎有較高的自我糾正率，說明隨著胚胎體外培養至囊胚期，其非整倍體和嵌合型胚胎有可能獲得修復，盡管非優質胚胎的囊胚形成率低，但囊胚培養能夠有效地淘汰一部分發育潛能差或染色體有異常的胚胎[5]，體外培養時間的延長為非優質胚胎的自我選擇提供了機會，從非優質的卵裂期胚胎中選出發育潛能好的胚胎[6]。

表4 胚胎囊胚形成速度的影響因素

表5 胚胎級別對胚胎囊胚形成速度的影響[%（n/n）]

卵裂期胚胎繼續培養，形成囊胚的影響因素很多，尤其對實驗室的體外培養體系有更高要求[3]。GLUJOVSKY等[7]分析顯示，囊胚移植在活產率方面優于卵裂期胚胎移植，但囊胚移植組延長的培養可能無囊胚形成，移植取消的概率高，使卵裂期胚胎的累計妊娠率優于囊胚移植，囊胚移植未顯現出明顯優勢。對于高齡等卵巢功能下降的患者，往往因獲卵數少、形成胚胎少，體外延長培養對有無囊胚形成而取消周期的風險更高[8]。本研究結果顯示，無囊胚形成亞組中非優質卵裂期胚胎構成比例高，對于第3天卵裂胚數目少且級別低的周期，為避免移植周期取消不主張繼續養囊胚，采用卵裂期胚胎移植更為合適。

YI等[9]比較發現D5囊胚種植率、臨床妊娠率和持續妊娠率明顯高于D5/D6組囊胚，認為囊胚發育速度能夠影響囊胚移植的結局。而任新玲等[10]研究認為，即使第6天發育至3期以上的囊胚，其復蘇后對妊娠結局也沒有影響，認為囊胚的發育速度對妊娠結局無影響。本研究結果顯示，囊胚形成速度快，移植后臨床種植率也高，其發育速度反映了胚胎質量和發育潛能。ALFARAWATI等[5]利用滋養層活檢對囊胚進行非整倍體發生率時發現，發育延遲的囊胚非整倍體率顯著高于正常發育組。這也解釋了移植D5囊胚比D6囊胚可獲得更好的妊娠結局。在行凍融囊胚移植時既要考慮囊胚評級，同時還應該參考胚齡。在復蘇周期中若有第5天囊胚和第6天囊胚可供選擇時，優先選擇第5天囊胚進行移植將獲得更好的臨床結局。

早期胚胎質量的評估對其后續發育潛能具有十分重要的預測作用，本研究結果顯示，HCG日E2水平與囊胚形成有關，有囊胚形成組HCG日E2水平明顯高于無囊胚形成組。提示卵巢功能好、獲卵數多患者，最終形成囊胚率高。有研究表明，卵裂期胚胎移植后，剩余姐妹胚胎的囊胚形成率與其臨床妊娠率呈正相關，認為移植卵裂胚可能與姐妹胚胎體外形成的囊胚具有相似的發育潛能[11]。不同促排卵方案根據自身特點不同，具有各自的優缺點。囊胚形成率高的組別中，標準長方案構成比高，拮抗劑方案構成比低，卵裂期胚胎質量本身是影響囊胚形成率的重要因素。總體囊胚形成率高的周期，授精方式中IVF授精比例更高，ICSI授精比例更低。IVF授精時卵周顆粒細胞對精子進行了優選，最后發生精卵結合的精子DNA完整性高。ICSI授精時選擇形態好的精子進行注射，無法識別精子內部結構是否存在異常[12]。研究表明，精子DNA碎片增多不影響卵母細胞授精，但可明顯降低其囊胚形成率。因此，相對于ICSI，常規IVF授精后的非優質胚胎具有更好的發育潛能。

綜上所述，對胚胎質量的評估手段依然需要不斷完善，對形態學評估為低等級的胚胎不應完全放棄，囊胚培養可幫助篩選出有發育潛能的胚胎，以提高胚胎的有效利用率和累計妊娠率。對于高齡、獲卵數少的患者，行低等級胚胎囊胚培養具有一定的風險，需謹慎。