幽門螺旋桿菌感染患兒胃黏膜組織中miR-146a表達及與TLR4/NF-κB信號通路的相關性

孫 波,周 方,李小芹

(鄭州大學附屬兒童醫院消化內科,鄭州 450000)

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)作為目前已知的消化性潰瘍、萎縮性胃炎主要致病因素，在胃癌發生及進展中發揮重要作用[1]。隨著診療手段的進步，小兒胃炎、胃潰瘍發病率不斷升高，且Hp感染陽性率較高[2]。研究表明，兒童時期是Hp感染的高發階段，且一旦感染可能終身受累[3]。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于機體內的短小RNA，在與特異性靶位結合后可通過影響其轉錄而在多種生理病理過程中發揮重要作用[4]。miR-146a是miRNA的重要類型，與機體固有免疫應答、炎性反應、病毒感染等密切相關[5]；尤其在消化道腫瘤的相關研究較多，也說明了其在消化道疾病中的重要性[6]。Toll樣受體4(toll-like receptor4，TLR4)/細胞核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路是調控機體炎性反應的重要通路，在促進炎性反應及多種炎癥因子釋放中發揮重要作用[7]。有研究指出，機體免疫炎性反應與Hp感染所致疾病密切相關[8]。故本研究通過分析Hp感染患兒胃黏膜組織中miR-146a表達變化，探討其與TKR4/NF-κB信號通路的相關性，以期為Hp感染致病機制的研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年2月至2016年12月在本院就診的患兒107例。納入標準：(1)以惡心、嘔吐、反酸、腹痛腹脹、嘔血或黑便為主要癥狀；(2)近2個月無抗生素、質子泵抑制劑、離子泵阻滯劑、激素使用史。排除標準：心肝腎等重要臟器嚴重功能障礙者，免疫系統功能障礙者，急慢性感染者，營養不良者，內分泌系統疾病者，惡性腫瘤者。其中，男61例，女46例，年齡4～14歲，平均年齡(9.32±3.11)歲。所有患兒均接受13C尿素呼氣試驗和組織病理Hp染色，根據二者檢查結果將患兒分為Hp感染組和非感染組，其中，Hp感染組58例，男35例，女23例，平均年齡(9.36±3.17)歲；非感染組49例，男26例，女23例，平均年齡(9.27±3.05)歲，病因分類：飲食因素39例，藥物刺激8例，膽汁反流2例。兩組患兒性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，均衡可比。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患兒家長均知情同意。

1.2主要試劑和設備 miRCURYTM原位雜交探針購自丹麥Exiqon公司，寡核苷酸探針稀釋液購自上海魯汶生物科技公司，地高辛標記探針購自德國Boerringer公司，生物素化鼠抗地高辛抗體和過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液購自武漢博士德生物工程公司，總RNA提取試劑盒(Trizol法)購自美國Mobio公司，反轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)公司，miR-146a和U6引物由上海生工生物公司設計合成，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1標本收集 所有患兒在行胃鏡檢查時，留取胃竇部胃黏膜組織4塊，2塊用4%甲醛固定石蠟包埋，分別用于檢測Hp感染和原位雜交試驗；另2塊置于液氮保存于-70 ℃冰箱，分別用于PCR和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。

1.3.2原位雜交試驗檢測患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達 取石蠟包埋組織，切片(厚度約2 mm)，脫蠟、水化，PBS沖洗2次，用0.3%枸櫞酸稀釋的蛋白酶消化10 min，PBS沖洗3次，室溫下4%多聚甲醛固定，焦碳酸二乙酯水洗，濕盒中42 ℃預雜交2 h。取地高辛標記探針miR-146a、U6陽性對照和無義對照(稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000和1∶1 500)，miR-146a探針序列：AAC CCA TGG AAT TCA GTT CTC A；U6陽性對照探針序列：CAC GAA TTT GCG TGT CAT CCT T；無義對照探針序列：GTGTAACACGTCTATACGCCCA。用雜交溶液進行稀釋，80 ℃變性3 min，冰上置2 min，過夜雜交。用枸櫞酸氯化鈉緩沖液洗滌，37 ℃封閉液封閉60 min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗體，室溫下孵育120 min，PBS洗滌3次，滴加過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，室溫下反應25 min，PBS洗滌3次，滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，封片觀察。結果判定：高倍鏡下隨機取5個視野計數細胞，陰性：陽性細胞比例<10%，陽性：陽性細胞比例≥10%。所有切片均由兩位病理科副主任醫師單獨完成閱片。

1.3.3實時熒光定量PCR術檢測患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達 取胃黏膜組織，研磨后加入細胞裂解液，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA純度。將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，用PCR試劑盒進行擴增，引物序列見表1。PCR反應條件：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 50 s，連續進行38次循環，72 ℃延伸10 min。用2-△△Ct法計算胃黏膜組織中miR-146a相對表達量。

表1 引物序列

1.3.4ELISA檢測患兒胃黏膜組織中炎癥因子水平 取胃黏膜組織，研磨后勻漿，于3 500 r/min離心10 min，取上清液，利用ELISA檢測黏膜組織中白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，所有操作均在標準條件下按試劑盒說明完成。

2 結 果

2.1患兒胃黏膜組織中miR-146a表達 原位雜交實驗結果顯示，miR-146a主要表達于細胞質中，被染成黃色或棕黃色顆粒狀。Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a陽性表達率為72.4%(42/58)，非感染組則為22.4%(11/49)，差異有統計學意義(χ2=26.526，P=0.000)，見圖1。

A：miR-146a在Hp感染組中呈高表達；B：miR-146a在非感染組中呈低表達

2.2兩組患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達 Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4 mRNA和NF-κB mRNA相對表達量均高于非感染組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3兩組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平 Hp感染組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均高于非感染組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 兩組患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達比較

表3 兩組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平比較

2.4Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a表達與其他指標的相關性 Pearson相關分析顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a相對表達量與TLR4 mRNA相對表達量、NF-κB mRNA相對表達量、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均呈正相關(r=0.307、0.384、0.265、0.271、0.292、0.345，P=0.002、0.000、0.044、0.040、0.013、0.008)。

3 討 論

慢性胃炎、消化性潰瘍作為小兒消化系統常見疾病，近年來發病率不斷升高，不僅給患兒身體帶來痛苦，而且可對患兒生長發育產生影響[9]。Hp作為一種在胃黏膜中寄生的需氧細菌，與慢性胃炎、消化性潰瘍等胃部疾病的發病密切相關[10]。研究發現，兒童期是Hp感染的高發期，感染率高達50%左右。但Hp致病的具體機制尚未完全清楚[11]。有研究指出，免疫炎性反應與Hp感染致病有關[12]。動物實驗表明，Hp感染小鼠胃黏膜組織中細胞因子改變[13]。本研究結果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均高于非感染組，說明Hp感染患兒胃黏膜組織中炎癥因子水平升高，可能參與了Hp所致胃病發病過程，與MICHALKIEWICZ等[14]研究結果相同。

miRNA作為機體內重要的非編碼RNA，在多種生理病理過程中發揮重要作用。有研究指出，miR-146a作為一種miRNA，是重要的固有免疫信號調節分子，在固有免疫應答中發揮重要作用[15]。miR-146a在強直性脊柱炎[16]、膿毒血癥患兒[17]外周血中表達上調。本研究原位雜交試驗結果顯示，miR-146a表達于細胞質中，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a陽性表達率高于非感染組，說明miR-146a在Hp感染患兒胃黏膜組織中呈高表達，可能參與了Hp感染致病過程。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a相對表達量高于非感染組，進一步說明miR-146a可能參與了Hp感染感染致病過程。研究表明，miR-146a主要調控Toll樣受體(TLR)2和TLR4通路，進而可誘導NF-κB信號通路活化而促進炎癥因子及促炎信號通路的激活[18]。趙娜等[19]指出，miR-146a可能是通過調控TLR4信號通路中相關分子表達而參與細菌脂多糖誘導神經膠質細胞BV2炎性反應。本研究結果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA相對表達量均高于非感染組，說明TLR4/NF-κB信號通路可能參與了Hp感染致病過程。相關分析結果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a相對表達量與TLR4 mRNA和NF-κB mRNA相對表達量、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均呈正相關，進一步說明miR-146a可能通過調控TLR4/NF-κB信號通路介導的炎性反應而在Hp感染致病過程中發揮重要作用。

綜上所述，Hp感染患兒胃黏膜組織中miR-146a呈高表達，可能通過調控TLR4/NF-κB信號通路介導的炎性反應參與了Hp感染致病過程，但具體作用機制尚待進一步研究明確，有望為Hp感染綜合防治提供新的靶位。