辛伐他汀對帕金森病大鼠的治療作用及其作用機制

陳 冬，歐陽存，張淑琴，鄧立軍，胡 昉

(江漢大學附屬武漢市第六醫院神經內科 430015)

帕金森病(parkinson disease,PD)主要是因中腦黒質區多巴胺能神經元進行性丟失而誘發的中樞神經系統退行性疾病。但現階段PD的發病機制尚不明晰[1]。多巴胺受體激動劑替代療法是現階段治療PD的重要方法，雖可在一定程度上緩解PD臨床癥狀，但無法阻止PD病程的進展[2]。此外，該類藥物的長期應用還可誘發多種不良反應。以辛伐他汀為代表的他汀類藥物是高脂血癥臨床治療的重要藥物，具有抗氧化、改善內皮功能、抗增生、抗炎、抗凝和穩定斑塊等多種作用[3]，可透過血腦屏障，在臨床上被廣泛用于降低血漿膽固醇水平。最新的流行病學研究發現，辛伐他汀還可通過神經保護效應發揮治療神經變性疾病的作用[4]。然而，關于辛伐他汀對神經退行性疾病的影響和機制還未被完全闡明。本研究旨在探討辛伐他汀對PD大鼠的治療作用及其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)實驗動物：選取SD雄性成年大鼠54只，體質量220～250 g，平均(234.1±8.2)g，光照間隔時間12 h、相對濕度45%～60%、溫度23～25 ℃、自由進食進水。(2)實驗儀器與藥品：阿普嗎啡、脂多糖(LPS)購于美國Sigma公司；C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒購于南京建成生物研究所；抗離子鈣結合蛋白1和酪氨酸羥化酶購于美國R&D公司；兔抗大鼠多克隆抗體購于南京凱基生物有限公司；大鼠定位儀購于上海高鴿公司；酶標儀購于美國BD公司。

1.2方法

1.2.1動物分組、造模及處理方法 選取SD雄性成年大鼠54只，采用隨機數字表法分為對照組、模型組、治療組各18只，模型組和治療組采用LPS誘導法建立PD大鼠模型，大鼠立體定位黑質區2 μL LPS注射(5 μg/μL)；對照組大鼠黑質區注射等量生理鹽水。治療組分別于造模前1 h及造模后每天17點腹腔注射辛伐他汀5 mg/kg，連續14 d，模型組和對照組給予等量生理鹽水腹腔注射[5]。

1.2.2觀察指標 (1)行為學觀察方法：大鼠連續給藥14 d后，腹腔注射阿普嗎啡0.05 mg/kg，記錄大鼠的旋轉圈數和方向；以大鼠后右側肢為支點，毀損對側開始旋轉，5 min記錄1次，連續觀察30 min[6]。(2)Western blot檢測各組大鼠黑質區一氧化氮合酶(iNOS)表達：行為學觀察結束第2天，大鼠斷頭處死，冰凍切片機取黑質區，稱重后裂解液勻漿并離心取上清液；BCA試劑盒檢測蛋白濃度；蛋白質樣品(50 μg)SDS-PAGE電泳并轉至PVDF膜，2 h脫脂奶粉封閉后加入一抗并4 ℃過夜；加入二抗后搖床2 h孵育，轉至PVDF膜上DAB顯色[7]。(3)ELISA檢測各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平：大鼠斷頭處死，冰凍切片機取黑質區，稱重后裂解液勻漿并離心取上清液，檢測CRP、TNF-α、IL-6水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。(4)免疫組織化學(IHC)染色：取大鼠黑質區和紋狀體，石蠟切片后抗離子鈣結合蛋白抗體、膠質纖維酸性蛋白及酪氨酸羥化酶IHC染色法檢測各組大鼠黑質區腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體(TrKB)、神經肽Y(NPY)的表達，最后結果使用Image-Pro圖形軟件進行分析[8]。

2 結 果

2.1各組大鼠行為學觀察 對照組、模型組、治療組大鼠旋轉圈數分別為(2.80±1.10)、(154.20±13.80)、(87.60±10.30)圈/分，治療組和模型組大鼠的旋轉圈數明顯多于對照組(P<0.05)，而治療組的旋轉圈數明顯少于模型組(P<0.05)。

2.2各組大鼠血清炎癥因子水平比較 治療組和模型組大鼠的血清CRP、TNF-α、IL-6明顯高于對照組(P<0.05)，而治療組的血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯低于模型組(P<0.05)；見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與模型組比較

2.3各組大鼠黑質區iNOS表達水平比較 對照組、模型組、治療組大鼠黑質區iNOS表達水平分別為(0.22±0.08)、(0.65±0.12)、(0.42±0.10)/NADPG%，治療組和模型組大鼠的黑質區iNOS表達強度明顯高于對照組(P<0.05)，而治療組的黑質區iNOS表達強度水平明顯低于模型組(P<0.05)。

2.4各組大鼠黑質區BDNF、TrKB、NPY表達水平比較 治療組和模型組大鼠的黑質區BDNF、TrKB、NPY表達強度明顯低于對照組(P<0.05)，而治療組的黑質區BDNF、TrKB、NPY水平明顯高于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠黑質區BDNF、TrKB、NPY表達水平

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與模型組比較

3 討 論

PD是一類神經退行性疾病，臨床癥狀多樣，存在認知功能障礙、疲勞癥狀等非運動癥狀及部分運動癥狀。但由于PD相關機制尚未明晰，導致現階段臨床缺乏有效的治療手段。有研究已證實辛伐他汀等他汀類藥物可以在改善神經退行性疾病方面發揮顯著的治療作用[9]，但目前對其神經保護作用的具體機制尚不明確。相關研究發現，他汀類藥物可經過免疫分子機制降低對神經元的損傷進而改善癡呆的臨床表征[10]；張陽等[11]通過多項臨床和基礎實驗對他汀類藥物從分子層面進行了總結，認為其具有抗氧化、抗炎和神經保護等多項功能，進而降低PD、腦血管病和癲癇等神經性疾病的發病率。本研究通過LPS建立大鼠PD模型，探討辛伐他汀對PD大鼠的治療作用及其作用機制，希望能夠為臨床PD的治療提供數據參考。本研究結果顯示治療組和模型組大鼠的旋轉圈數明顯多于對照組(P<0.05)，而治療組的旋轉圈數明顯低于模型組(P<0.05)。該結果從行為學角度研究認為辛伐他汀能明顯改善PD大鼠的臨床表征。

有基礎實驗發現，黑質多巴胺神經元的退行性病變與TNF-α和炎癥因子具有密切聯系，并認為TNF-α與IL-6的表達可損傷DA神經[12]。CRP是機體非特異性免疫機制的一部分，可激活補體的經典途徑，增強白細胞的吞噬作用，調節淋巴細胞或單核/巨噬系統功能，促進巨噬細胞組織因子的生成[13]。本研究發現治療組和模型組大鼠的血清CRP、TNF-α、IL-6明顯高于對照組(P<0.05)，治療組的血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯低于模型組(P<0.05)。該結果提示辛伐他汀可通過炎性反應水平改善PD大鼠的臨床癥狀。

SHALBAY等[14]研究發現，AD、PD等多種疾病和神經系統功能損傷均存在iNOS的表達。本研究發現治療組和模型組大鼠的黑質區iNOS表達強度明顯高于對照組(P<0.05)，治療組的黑質區iNOS表達強度水平明顯低于模型組(P<0.05)。上述結果提示辛伐他汀可通過對激活的神經膠質細胞介導的氧化應激反應產生抑制作用。治療組和模型組大鼠的黑質區BDNF、TrKB、NPY表達強度明顯低于對照組(P<0.05)，但治療組的黑質區BDNF、TrKB、NPY水平明顯高于模型組(P<0.05)。該結果說明辛伐他汀可通過改善BDNF、TrKB、NPY的活性達到治療PD大鼠的效果。相關研究發現，TrKB受體可通過自動磷酸化與配體BDNF共價結合激活細胞內信號轉導途徑；軸突切斷后，脊髓內運動神經元可出現TrKBmRNA表達增加[15]，提示BDNF有可能通過其受體TrKB受體發揮再生與存活效應。

綜上所述，辛伐他汀能明顯降低PD大鼠的炎性反應水平、改善BDNF、TrKB、NPY的活性及降低iNOS表達，從而達到治療PD大鼠的效果。