高強度超聲處理對鵝胸肉肌動球蛋白特性的影響

張 坤，鄒 燁*，王道營*，張新笑，陳 琳，諸永志，徐為民3

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210046；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

鵝肉營養(yǎng)豐富、肉質鮮美，不僅具有高蛋白、低脂肪和低膽固醇等特點[1]，而且富含亞油酸等多種不飽和脂肪酸[2]，蛋白質含量高于同為禽類的雞、鴨肉等，且其所含各種氨基酸組成接近人體所需氨基酸比例，有較好的消化吸收率[3]，具有食藥兩用功能，因此深受消費者喜愛。然而，鵝肉肌原纖維較粗，肌纖維間多覆有結締組織[4]，肌肉硬度大且保水性差，肉質粗老、不易咀嚼；因此，發(fā)展適宜的鵝肉嫩化處理技術具有現實意義。

肌原纖維是肌肉的伸縮裝置，主要由粗絲和細絲組成，粗絲為肌球蛋白絲，細絲為肌動蛋白絲[5]。肌肉中，肌動蛋白和肌球蛋白可結合形成肌動球蛋白，此時肌原纖維粗絲（肌球蛋白）和細絲（肌動蛋白）緊密結合[6]，肌肉收縮，肉質變硬、嫩度變差。肌動球蛋白在肌肉中存在的狀態(tài)與肌肉嫩度息息相關，當肌動球蛋白受到內源酶等影響解離為小分子的肌動蛋白和肌球蛋白時，肌肉僵直狀態(tài)緩解、嫩度改善。因此，促進肌動球蛋白解離、抑制肌原纖維收縮、破壞肌原纖維的緊密結構是改善肉質嫩度的關鍵。超聲波嫩化技術是90年代初提出的一種全新嫩化技術，近年來的研究表明超聲處理對肌肉嫩度有顯著的改善效果[7-8]。超聲波的“空化效應”和“機械作用”使肉受迫振動[9]，破壞肌肉結構，改變肌肉蛋白質間的連接鍵[10]，從而改善肉品品質。但是，關于超聲處理是否通過改變肌動球蛋白的結構性質進而影響肌肉嫩度仍需進一步探索。本研究通過分析鵝胸肉超聲處理后提取的肌動球蛋白的理化及生化特性，研究超聲處理對鵝胸肉肌動球蛋白的影響，以期為探究鵝肉嫩化機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉用揚州鵝購自江蘇省常州市陽湖養(yǎng)鵝業(yè)專業(yè)合作社，隨機選取90 日齡左右、質量在15 kg左右的健康鵝，按企業(yè)工藝要求宰殺后立即取出鵝的左、右兩塊胸肉，待用。

超微量總ATP酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；組織蛋白酶B、D、L、H活力試劑盒 美國Biovision公司；BCA試劑盒 南京建成生物科技公司。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；T-25型數顯勻漿機 德國IKA公司；UniCenMR冷凍離心機 德國Herolab公司；UV-6100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；多功能酶標儀 美國Biotek儀器有限公司；傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；J-1500圓二色（circular dichroism，CD）光譜儀日本JASCO公司；Zetasizer Nano Zs90納米粒度儀英國馬爾文公司；MCR302流變儀 奧地利Anton Paar公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 德國ZEISS Oberkochen公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗材料處理

取1.1節(jié)中鵝胸肉混合打亂順序后，選取大小、薄厚相近的鵝胸肉，剔除肌膜、結締組織和脂肪組織，待用。隨機選取鵝胸肉，分為兩個處理組：其中一組進行超聲處理（功率800 W、總時間42 min、工作時間2 s、停歇時間3 s），另一組未經超聲處理作為對照組。于4 ℃成熟48 h，分別在0、6、12、24、36、48 h取樣，經液氮速凍后放入－40 ℃冰箱待用。每個處理組均隨機選取3 塊鵝胸肉進行實驗，做3 個平行。

1.3.2 肌動球蛋白的提取

參考Okitani等[11]的方法提取肌動球蛋白：每個樣品取2 g肉樣，加入20 mL Weber溶液（0.6 mol/L KCl、0.04 mol/L NaHCO3、0.01 mol/L Na2CO3，pH 7.2），冰浴勻漿（12 000 r/min、30 s/次，重復2 次，中間間隔10 s）。勻漿液置于搖床振蕩24 h（200 r/min、4 ℃），用兩層紗布過濾除去不溶物質。每10 mL濾液中加入20 mL超純水稀釋，調整濾液中KCl濃度為0.2 mol/L，再次于搖床（200 r/min、4 ℃）振蕩1 h后離心（4 ℃、15 000×g、20 min），上清液即為游離肌動蛋白溶液。將沉淀溶解于KCl-Tris溶液（0.6 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl、pH 7.2）中，即為肌動球蛋白溶液。

蛋白質量濃度用BCA試劑盒測定。部分肌動球蛋白溶液經冷凍干燥處理，用于FTIR光譜分析及SEM觀察。剩余肌動球蛋白溶液用KCl-Tris溶液稀釋到蛋白質量濃度1.0 mg/mL，用于相關實驗。

1.3.3 肌動球蛋白的紫外光譜測定

稀釋肌動球蛋白溶液質量濃度為0.5 mg/mL，使用紫外-可見分光光度計的全波長掃描模式，掃描蛋白溶液200～400 nm波長范圍內的紫外吸收光譜，對掃描結果作圖。

1.3.4 肌動球蛋白的內源熒光光譜測定

用熒光分光光度計測定質量濃度為0.5 mg/mL的肌動球蛋白溶液的內源熒光光譜。儀器參數設定：激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長300～500 nm；掃描速率1 200 nm/min；單元狹縫寬度5.0 nm。

1.3.5 肌動球蛋白的FTIR光譜測定

取1 mg 1.3.2節(jié)中經冷凍干燥處理得到的肌動球蛋白粉末樣品，與100 mg溴化鉀混合研磨、壓片。用OMNIC軟件對數據進行校正，減差背景譜圖，限制譜帶范圍為1 200～1 700 cm－1。確定各峰與官能基團的對應關系，進而了解肌動球蛋白二級結構的變化情況。

1.3.6 肌動球蛋白ATPase活力的測定

ATPase活力用超微量總ATP酶試劑盒檢測?；緦嶒灢襟E如下：向已測定蛋白質量濃度的游離肌動球蛋白溶液中加入一定比例基質液進行樣品前處理，離心后取上清液，定磷。將樣品、對照品根據說明書進行反應，并按試劑盒要求做標準組和空白組，靜置2 min后加入終止液終止反應，使用雙蒸水調零，測定各管在636 nm波長處的OD值。每個樣品做3 個平行，取平均值。按試劑盒說明書計算ATPase活力。

1.3.7 肌動球蛋白的CD光譜測定

調節(jié)肌動球蛋白質量濃度為0.1 mg/mL，參比溶液為KCl-Tris溶液，使用1 mm石英比色皿，掃描范圍設定為190～250 nm，步階為0.5 nm，對肌動球蛋白溶液進行掃描。掃描結束后使用CD光譜儀軟件輸入樣品蛋白質量濃度，計算得到樣品蛋白二級結構含量。

1.3.8 肌動球蛋白Zeta電位的測定

將蛋白溶液注入Zeta電位皿進行Zeta電位測定。設置參數為：散射角90°、平衡時間120 s、測試溫度25 ℃，3 次測定取平均值。

1.3.9 肌動球蛋白粒徑的測定

調節(jié)肌動球蛋白質量濃度為1.0 mg/mL。將蛋白溶液緩慢加入動態(tài)光散射粒度儀中進行測試。取連續(xù)3 次測試的平均值為最終粒徑分布。

1.3.10 肌動球蛋白靜態(tài)流變特性的測定

質量濃度為1.0 mg/mL的肌動球蛋白溶液在室溫下使用流變儀測定其靜態(tài)流變性質。流變儀參數設定為：選擇PP50轉子，設定固定應變?yōu)?%，剪切速率為0～10 s－1，狹縫距離為1 mm，測定溫度恒定在（25.0±0.1）℃。取1～2 mL配制好的肌動球蛋白溶液于流變儀底部平板上，讓板間充滿樣品（樣品無氣泡且防止樣品過多流出平板），測定整個過程中樣品黏度隨剪切速率的變化曲線，每個樣品3 次重復取均值。

1.3.11 肌動球蛋白組織蛋白酶活力的測定

用BCA試劑盒測定肌動球蛋白質量濃度。組織蛋白酶活力用組織蛋白酶B、D、L、H活力試劑盒測定，以50 μL肌動球蛋白溶液與50 μL緩沖液以及2 μL底物在37 ℃下孵育1.5 h，用多功能酶標儀測其OD值。按說明書計算組織蛋白酶相對活力。

1.3.12 肌動球蛋白SEM觀察

取1.3.2節(jié)中冷凍干燥處理得到的肌動球蛋白粉末樣品，噴金鍍膜后使用SEM觀察其超微結構。

1.4 數據分析

采用Excel軟件統(tǒng)計數據，使用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析和相關性分析，P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 肌動球蛋白紫外光譜的變化分析

圖1 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of storage time after ultrasonic treatment on ultraviolet spectra of actomyosin

如圖1所示，超聲組與對照組的最大吸收峰均在波長280 nm左右，但吸收峰的位置和強度均有所改變。超聲組較對照組有明顯的增色效應，且吸收峰略向短波長方向移動，有藍移趨勢。這可能是因為超聲處理導致蛋白肽鏈伸展，氨基酸芳雜環(huán)的疏水基團暴露，分子間相互作用增加[12-13]，導致280 nm波長處紫外吸收增強；同時，由于氨基酸疏水基團間的疏水作用減弱，共軛結構n→π*躍遷能量增大[14]，吸收峰藍移，說明肌動蛋白和肌球蛋白間相互作用改變，肌動球蛋白分子構象發(fā)生改變。

2.2 肌動球蛋白內源熒光光譜變化分析

圖2 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白熒光光譜的影響Fig.2 Effect of storage time after ultrasonic treatment on fluorescence spectrum of actomyosin

蛋白質因含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基而具有內源熒光[15]，由圖2可見，肌動球蛋白在335 nm波長左右有一個強熒光發(fā)射峰，不同處理方式和放置時間的肌動球蛋白熒光發(fā)射峰位置變化不大，但熒光強度有明顯變化。超聲組肌動球蛋白的熒光強度明顯高于對照組，且隨著放置時間的延長，對照組和超聲組的熒光最大發(fā)射峰均有較小程度的紅移。蛋白質因分子間作用力結合會引起熒光強度降低，即靜態(tài)熒光猝滅[16]，對照組較超聲組有熒光猝滅現象，可能是由于肌動蛋白和肌球蛋白結合引起的。而超聲組放置0～6 h內源熒光強度最大，此時鵝胸肉中肌動球蛋白含量較低。另外，隨著放置時間的延長熒光發(fā)射峰出現較小程度的紅移現象，說明放置過程中肌肉中色氨酸或酪氨酸周圍其他氨基酸的空間排布和相互作用發(fā)生了細微變化，從而引起蛋白質極性和肌動球蛋白分子的構象發(fā)生變化[15]，這也與2.1節(jié)紫外光譜分析結果一致。

2.3 肌動球蛋白FTIR光譜變化分析

圖3 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白FTIR光譜的影響Fig.3 Effect of storage time after ultrasonic treatment on FTIR spectrum of actomyosin

FTIR光譜是研究氫鍵類型的有力手段，而蛋白質的二級結構與蛋白分子間的氫鍵類型密切相關，蛋白質在紅外區(qū)域有若干特征吸收帶[17]，如酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）、酰胺II帶（1 550～1 600 cm－1）和酰胺III帶（1 220～1 320 cm－1）。由圖3A、B可以看出，不同處理方式及放置時間的肌動球蛋白的FTIR圖譜在圖形上十分相似，但相互之間仍有差別。由于酰胺I帶峰強最強，且對研究蛋白質二級結構最有價值，因此主要通過分析酰胺I帶研究超聲處理對肌動球蛋白分子的影響。對照組酰胺I帶峰強高于超聲組，且峰位置藍移。造成峰強變化的原因之一是蛋白質的構象變化，這是氫鍵和誘導效應的共同影響造成的，結合2.1節(jié)紫外光譜分析和2.2節(jié)內源熒光光譜分析結果，超聲處理和放置時間能夠影響肌動球蛋白分子的構象變化，對分子間空間排布和相互作用也有一定改變。

2.4 肌動球蛋白ATPase活力變化分析

肌球蛋白與肌動蛋白間相互作用力的強弱可以用肌動球蛋白ATPase活力表示。肌動球蛋白ATPase活力的大小表征了肌動球蛋白的完整性，ATPase活力增大表示肌動蛋白與肌球蛋白間相互作用力增強，肌動蛋白與肌球蛋白結合形成肌動球蛋白。

圖4 超聲處理后放置時間對肌動球蛋白ATP酶活力的影響Fig.4 Effect of storage time after ultrasonic treatment on ATPase activity of actomyosin

從圖4可以看出，對照組肌動球蛋白放置0～6 h ATPase活力顯著升高（P＜0.05），放置6～48 h則開始降低，這是因為肌肉宰后成熟過程中，攜帶ATP的肌球蛋白與肌動蛋白結合形成肌動球蛋白，此時大量的ATPase被激活從而分解ATP，釋放能量，肌動蛋白與肌球蛋白間相互作用力增強，肌肉收縮[18-19]。隨著放置時間的延長，ATP不斷被消耗，ATP水解產物如一磷酸腺苷、肌苷酸以及PO43－等不斷積累，這些水解產物有助于肌動球蛋白發(fā)生不可逆解離[11,20]，肌動蛋白和肌球蛋白間相互作用力減弱，肌動球蛋白ATPase活力顯著降低，從而使肌肉嫩度改善。同時，對照組ATPase活力顯著高于超聲組（P＜0.05）。超聲組放置0～6 h及36～48 h樣品的ATPase活力變化不顯著（P＞0.05），而放置12～24 h肌動球蛋白的ATPase活力顯著低于放置0～6 h及36～48 h（P＜0.05）。這可能是因為超聲處理加速了宰后肌肉的成熟期，“機械效應”和“空化效應”對肌動球蛋白完整結構造成破壞，肌動球蛋白大量解離，肌動蛋白和肌球蛋白間作用力減弱趨于穩(wěn)定，使肌動球蛋白ATPase活力達到最低點并趨于穩(wěn)定。

2.5 肌動球蛋白CD光譜變化分析

CD光譜的遠紫外區(qū)（190～240 nm）圓二色性主要由肽鍵的電子躍遷引起，反映了肽鏈主鏈的構象，常用于蛋白質二級結構分析。不同蛋白質二級結構產生的CD譜帶峰強和位置不同，因此可以根據遠紫外CD光譜分析蛋白質的二級結構信息。

圖5 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白CD光譜的影響Fig.5 Effect of storage time after ultrasonic treatment on CD spectrum of actomyosin

表1 超聲處理后不同放置時間鵝胸肉的肌動球蛋白二級結構含量Table1 Secondary structure contents of actomyosin after ultrasonic treatment during different storage times%

α-螺旋在CD光譜中有3 個特征峰，分別為192 nm波長處的一個正峰以及208、222 nm波長處兩個負峰。由圖5和表1可知，隨著放置時間的延長，對照組192 nm波長處正峰和208 nm波長處負峰峰強度均呈先增大后減小趨勢，超聲組則相反，而α-螺旋含量與峰強度成正比。肌動球蛋白中，肌球蛋白的兩個球狀頭區(qū)域均有非共價鍵輕鏈，尾部有一個α-螺旋[21]。另外，肌球蛋白中48%的氨基酸殘基包含在α-螺旋中，所以α-螺旋含量的變化可以反映肌動球蛋白結構的變化[22]。圖5和表1中反映的肌動球蛋白二級結構含量的變化，可能是超聲波的“空化效應”以及放置過程中肌肉內部結構變化，使α-螺旋肽鏈伸展變?yōu)榫€性的β-折疊，從而引起肌球蛋白結構發(fā)生變化，使得肌球蛋白與肌動蛋白結合作用發(fā)生變化，進而使肌動球蛋白的構象發(fā)生變化。

2.6 肌動球蛋白Zeta電位變化分析

由于蛋白的Zeta電位與肌原纖維絲間/內的靜電斥力及肌動球蛋白的形成或解離相關[23]，因此可用Zeta電位描述不同處理條件下蛋白的帶電情況。如圖6所示，超聲處理前后肌動球蛋白的Zeta電位均為負值，說明肌動球蛋白帶負電荷，分子間表現為靜電斥力。隨著放置時間的延長，超聲組Zeta電位絕對值先增大后減小，在放置24 h時最大，即靜電斥力先增大后減小，對照組則相反。這可能是因為對照組放置過程為鵝胸肉宰后成熟過程，隨著放置時間的延長，肌肉中ATP含量減少，肌動蛋白與肌球蛋白結合，帶電基團隱藏，分子間靜電斥力減小，隨后肌肉進入解僵期，肌動球蛋白解離，分子間斥力開始增大。而超聲波的“空化效應”和“機械效應”加速了蛋白聚集體降解，不利于蛋白之間相互作用，從而使肌動球蛋白解離，蛋白質分子鏈展開，暴露出帶電基團和疏水基團，Zeta電位絕對值增大，而蛋白質分子鏈的過度展開可能導致靜電斥力減小[24-25]，因此Zeta電位絕對值在放置24～48 h時降低。

圖6 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白Zeta電位的影響Fig.6 Effect of storage time after ultrasonic treatment on zeta potential of actomyosin

2.7 肌動球蛋白粒徑變化分析

蛋白質的粒徑是蛋白質結構的宏觀表現。由圖7可以看出，超聲處理使蛋白的粒徑較對照組顯著減小，而對照組蛋白粒徑隨放置時間的延長呈先增大后減小趨勢。對照組未經處理，鵝胸肉自然成熟解僵的過程也是肌動球蛋白形成和解離的過程，其粒徑與肌動球蛋白的形成呈正相關。而超聲波的“空化效應”產生極強的物理力，導致肌原纖維破碎，加快了肌動球蛋白的降解，使大分子蛋白分解為小分子，蛋白顆粒更為均勻有序，因此隨著放置時間的延長，超聲組蛋白粒徑變化不大。

圖7 超聲處理后不同放置時間鵝胸肉的肌動球蛋白粒徑Fig.7 Particle size of actomyosin protein after ultrasonic treatment during different storage times

2.8 肌動球蛋白靜態(tài)流變特性的變化分析

圖8 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白黏度的影響Fig.8 Effect of storage time after ultrasonic treatment on viscosity of actomyosin

如圖8所示，在0～0.3 s－1時對照組和超聲組黏度均急劇下降，0.3～10 s－1時降速變緩，最終黏度趨于0，且超聲組肌動球蛋白黏度顯著低于對照組。這可能是因為放置時間的延長以及超聲波的“空化效應”和“機械作用”使肌原纖維破碎、肌動球蛋白降解，蛋白的交聯(lián)和相互作用減弱[26]，肽鏈長度變短，蛋白顆粒變得小而有序，因此蛋白黏度減小，這也與2.7節(jié)粒徑變化結論相符。

2.9 肌動球蛋白組織蛋白酶活力變化分析

Calkins等[27]的研究發(fā)現，動物宰后肌肉嫩度的變化與組織蛋白酶的作用顯著相關，在宰后成熟過程中，蛋白降解導致肌肉快速軟化，這主要歸因于組織蛋白酶B、D、L、H的作用，Yamashita[28]、García-Garrido[29]等的研究也證實了這一點。組織蛋白酶B、D、L、H能降解多種蛋白質，如肌球蛋白重鏈、α-輔肌動蛋白、結蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白、伴肌動蛋白、原肌球蛋白等一系列與肌肉嫩度相關的蛋白，不同的組織蛋白酶能夠特異性降解不同蛋白質。

圖9 超聲處理后放置時間對鵝胸肉肌動球蛋白組織蛋白酶B（A）、D（B）、H（C）、L（D）活力的影響Fig.9 Effect of storage time after ultrasonic treatment on cathepsin B (A), D (B), H (C) and L (D) activities of actomyosin

由圖9可以看出，超聲組肌動球蛋白的組織蛋白酶活力顯著高于對照組。隨著放置時間的延長，對照組組織蛋白酶活力整體變化不顯著。如圖9A所示，對照組放置0～36 h時組織蛋白酶B活力無顯著變化（P＞0.05），放置36～48 h時組織蛋白酶B活力顯著升高（P＜0.05）。這可能是因為宰后成熟前期，肌動蛋白和肌球蛋白結合形成肌動球蛋白，肌肉僵直，肌纖維結構緊密、完整，組織蛋白酶存在于骨骼肌的細胞溶酶體中，只有從溶酶體中釋放出來才能發(fā)揮水解蛋白質的作用，因此0～36 h時蛋白酶活力變化較小甚至無顯著變化（P＞0.05）。隨著放置時間的延長，肌肉進入解僵期，溶酶體中的組織蛋白酶被逐漸釋放出來，組織蛋白酶活力開始升高，肌動球蛋白被降解，肌纖維結構趨于松散無序。

超聲組組織蛋白酶B、D、H的活力隨著放置時間的延長呈先升高后下降趨勢，且在超聲處理后12 h時酶活力最高。這可能是因為超聲波的強穿透力和“空化效應”使組織結構在短時間內遭到破壞，縮短了肌肉宰后成熟過程。由于細胞結構破壞，組織蛋白酶從溶酶體中釋放，活力升高，進一步加速蛋白質的降解。而放置12～48 h組織蛋白酶活力的下降可能是因為鵝胸肉中pH值變化所致。

2.1 0 肌動球蛋白SEM觀察結果

由圖10可以看出，超聲組肌動球蛋白顆粒顯著小于對照組，隨著放置時間的延長，對照組肌動球蛋白由規(guī)則、緊密變得松散，聚合的蛋白變?yōu)樾》肿宇w粒，蛋白粒徑越來越小，與肌動球蛋白粒徑變化結果相符。超聲組放置48 h時肌動球蛋白排列重新變得有序，但粒徑和形態(tài)與對照組相比仍具有顯著差異，這也與前文蛋白質構象發(fā)生明顯改變的結論一致。

圖10 超聲處理鵝胸肉肌動球蛋白的SEM觀察結果Fig.10 SEM of actomyosin after ultrasonic treatment

3 結 論

本實驗對在4 ℃下放置不同時間對照組和超聲組鵝胸肉的肌動球蛋白進行分析，結果表明，與對照組相比，超聲處理的鵝胸肉肌動球蛋白微環(huán)境和構象發(fā)生改變，ATPase活力顯著減小，組織蛋白酶活力顯著增大，肌動球蛋白粒徑明顯減小，Zeta電位絕對值明顯升高，蛋白黏度降低，蛋白表面微觀結構發(fā)生明顯變化。但這仍需進一步實驗以確定肌動球蛋白解離與超聲波嫩化之間的關系，從而更清楚地了解鵝胸肉的宰后成熟機理，為進一步改善鵝肉品質提供理論依據。