中國對蝦超聲輔助解凍的數值模擬及對蛋白變性的影響

李 慢，呂瑞玲，王丹麗，馬曉彬，丁 甜，凌建剛,2，劉東紅,3,*

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；2.寧波市農業科學院農產品加工研究所，浙江 寧波 315040；3.浙江大學馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

中國對蝦肉質鮮美、營養豐富，是廣受歡迎的水產品之一；2016年的統計顯示，中國對蝦的養殖產量達到39 288 t，在水產品交易市場上占據了一定的份額[1]，但由于其水分含量高、組織脆弱，極容易黑變、腐敗，因而冷凍保藏十分重要。凍藏是目前中國對蝦保鮮貯藏最常用的方式之一，其最終品質不僅受冷凍方法及冷凍速率的影響，也與解凍過程有直接的關系，不當的解凍方法會加速食品理化性質的變化以及微生物的生長，使凍結食品品質劣變，從而降低其營養價值和經濟價值；因此尋求一種中國對蝦的合理解凍方法十分重要[2-5]。

近年來，超聲輔助解凍作為一種新型的解凍方式受到人們的關注[6-7]。Li Bin等[8]提出聲波解凍能縮短解凍時間，減少汁液損失并提高產品質量；Gambuteanu等[9]比較了不同功率的超聲輔助解凍和水解凍對豬肉理化性質的影響，結果表明超聲強度為0.6 W/cm2時，相變區的解凍時間較靜水解凍縮短了80%，同時超聲輔助解凍后的豬肉品質與對照組無顯著差異。目前針對解凍處理過程中解凍速率與溫度分布的研究還較為缺乏，如果能精確掌握解凍食品內部的溫度分布、變化趨勢以及解凍時間，將對優化解凍工藝、加快生產效率、提高食品品質有重要的意義。計算機技術的飛速發展使得應用數值模擬法求解產品解凍過程的傳熱問題成為可能[10]。Birla等[11]用FEMLAB軟件來模擬水果的射頻解凍過程，其設計實驗驗證用結冷膠制作的水果模型解凍過程中的溫度分布，結果證明模擬結果與實驗結果十分吻合，該模型能成功預測解凍過程中的瞬時溫度分布。

現階段對解凍過程中的傳熱模擬已有很多研究，但大都集中在對射頻解凍和微波解凍的模擬[11-13]，而對超聲輔助解凍的有限元模擬幾乎沒有相關研究。本實驗以中國對蝦為研究對象，探究超聲輔助解凍對蛋白變性的影響，旨在為中國對蝦科學合理的解凍方法提供參考；同時應用COMSOL Multiphysics 5.2a軟件模擬超聲輔助解凍中國對蝦的過程，建立食品的熱物理學性質隨時間變化的超聲-熱傳導雙向耦合模型，并對模擬結果進行實驗驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮中國對蝦購于杭州駱家莊農貿市場，其大小、形態一致，質量（11.0±0.5）g，鮮活無異味。

牛血清白蛋白 上海阿拉丁試劑有限公司；考馬斯亮藍 生工生物工程（上海）有限公司；寬分子質量蛋白標準 美國Thermo Scientific公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）、凝膠配制試劑盒、上樣緩沖液 上海碧云天生物科技有限公司；其他試劑均為分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

Data Trace MP III無線溫度傳感器及工作站 美國Mesa Labs公司；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FSH-2可調高速勻漿機 金壇市鴻科儀器廠；PowerPacTM基礎電泳儀、電泳槽 美國Bio-Rad公司；MultiskanTM GO全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國安捷倫公司；HH-10數顯恒溫攪拌水浴鍋 金壇市科杰儀器廠；UV 2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MDS1差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.3 模型的建立和驗證

1.3.1 超聲輔助解凍裝置與對蝦幾何模型

圖1 超聲輔助解凍裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental setup for ultrasound-assisted thawing

解凍裝置如圖1所示，超聲輔助解凍槽是半徑50 mm、高150 mm的圓柱形水槽，其中液面高度為120 mm，解凍介質為水。將待解凍的對蝦放置在高度為25 mm的鏤空金屬網支架上進行解凍。在設計模型時，忽略對蝦的頭部和尾鰭（均不含肌肉組織），以含肌肉為主的蝦腹為模擬對象。由于對蝦不規則的形態，在建模過程中，通過測量形態、大小近似的對蝦的尺寸，取其平均值，再依照其尺寸和形狀建立對蝦的3D幾何模型（圖2）。

圖2 中國對蝦的幾何模型以及所劃分的網格Fig.2 Computational geometry of Chinese shrimp body and the obtained mesh

建立模型時，選用固體傳熱和壓力聲場兩個物理場，根據實驗裝置建立幾何模型，相關參數見表1所示，其中解凍介質水的基本參數由COMSOL Multiphysics軟件提供。為了簡化研究，建立模型時有幾下幾點假設[14-18]：1）對蝦在解凍過程中與外界環境僅有熱交換；2）對蝦各組成部分均為各向同性的均勻體，忽略蝦殼對傳熱造成的影響；3）對蝦在解凍過程中，蝦體內部熱交換只考慮導熱，不考慮對流傳熱；4）解凍初始，對蝦溫度和水分分布均勻且一致。

表1 相關參數Table1 Relevant parameters

1.3.2 超聲輔助解凍的理論基礎

超聲輔助解凍是多物理場問題，其中傳熱控制方程見式（1）。

式中：T表示對蝦的溫度/℃；t表示解凍時間/s；ρ表示蝦肉的密度/（kg/m3）；Cp表示對蝦的比熱容/（J/（kg·K））；k表示對蝦的熱導率/（W/（m·K））；Q0表示單位體積物料所吸收的超聲能量/（W/m3）。

Q0、聲壓（P）、聲強（I）的計算分別見式（2）～（4）。

由式（3）、（4）得式（5）。

式中：ω表示超聲的角頻率/（rad/s）；α表示超聲在物料中的衰減系數/m－1；A表示超聲探頭的振幅/m；c表示聲波在物料中的傳播速率/（m/s）。

1.3.3 邊界條件及初始條件

對蝦底面在解凍過程中一直與鏤空金屬支撐網接觸，但因其導熱作用小，故忽略不計。對蝦與解凍裝置中的水發生對流換熱，視為第三類邊界條件[22]，具體由式（6）表示。

式中：h是對流傳熱系數，超聲輔助解凍時取350 W/（m2·K），水解凍時取200 W/（m2·K）[23]；T是對蝦的表面溫度/℃；T水表示介質水的溫度（15 ℃）。

凍結的對蝦內部各項均勻，溫度一致，因此對蝦的初始條件方程由式（7）表示。

式中：T0是對蝦的初始溫度（－18 ℃）。

1.3.4 對蝦熱物性參數的確定

對蝦在解凍過程中會發生相變，大部分冰晶融化成水，其熱物性會發生較大變化。為準確模擬和預測凍結過程中的溫度場及解凍時間，故采用分段多項式數學模型來反映對蝦的熱物性變化規律[18]。確定對蝦的主要成分是合理計算對蝦熱物理參數的基礎，經測定，其主要成分水分、蛋白質、灰分、脂肪的質量分數分別近似為78%、19%、2%、1%。各組分的熱物理性質參考李云飛等[25]編著的《食品工程原理》。

由馮亦步[26]的研究可知，蝦中冰的質量分數（ω冰）、已解凍的水的質量分數（ωw）計算分別見式（8）、（9）。

式中：Tf是初始凍結溫度/℃；T是蝦體溫度/℃；ω’水是對蝦中總的水分質量分數/%；根據凍結曲線可知，對蝦的Tf為－2 ℃；ω冰是對蝦中在解凍過程中冰的質量分數。

早期對食品解凍的模擬大多假設食品熱物性參數在解凍過程中為常數，而實際上食品的熱物性參數在解凍過程中有較大的變化，特別是含水量高的食品。食品解凍發生在一定的溫度范圍內而非某一特定溫度，由于解凍涉及到食品中水的相變過程，需要吸收大量的相變潛熱，同時食品的密度、比熱容和熱導率等熱物理性質會隨著解凍的進行不斷發生變化。本實驗模擬采用固定網格法中的顯熱容法對潛熱釋放進行處理，即把相變潛熱看作是在相變區域內有一個很大的顯熱容，這樣就能將分區描述的控制方程及界面能量守恒條件轉化成在整個區域上適用的單一非線性導熱方程。同時采用變熱物性方程來反映中國對蝦在解凍過程中熱物性參數隨溫度變化而相應變化的值[21]。

對蝦比熱容（Cp/（J/（kg·K）））、熱導率（k/（W/（m·K）））、密度（ρ/（kg/m3））的計算分別見式（10）～（12）[26-27]。

式中：ωi表示各組分的質量分數/%；Cpi表示各組分對應的比熱容/（J/（kg·K））；L表示水的潛熱/（J/mol）；ki表示各組分對應的熱導率/（W/（m·K）；ρi表示各組分對應的密度/（kg/m3）。

對蝦的比熱容、熱導率以及密度隨溫度變化的趨勢如圖3所示。

圖3 對蝦隨溫度變化的熱物性參數Fig.3 Thermal properties of Chinese shrimp as a function of temperature

1.3.5 模型的驗證以及超聲輔助解凍對中國對蝦蛋白變性的影響

選用與模型大小、形態近似的新鮮對蝦，冰水致死后，去頭、尾鰭。將溫度探頭插入至對蝦最大截面處的中心位置，即蝦體幾何中心部位視為對蝦的溫度最低點，用來記錄對蝦在解凍過程中中心溫度的變化。對蝦在－18 ℃下凍藏48 h后，取出并置于超聲輔助解凍裝置中進行超聲輔助解凍，超聲強度為0.2 W/mL。對照組是在相同條件下僅去掉超聲作用的靜水解凍。其中，解凍介質均恒溫在15 ℃。

為了驗證有限元模擬模型的精度，采用均方根誤差（root mean square error，RMSE）（式（13））對模擬及實測結果間的差異進行統計檢驗。

式中：Tm表示模擬溫度/℃；T表示對蝦的實測中心溫度/℃；i表示數據節點編號；n表示數據點總數。

為探究超聲輔助解凍對中國對蝦蛋白變性的影響，取解凍后的樣品進行以下指標測定。

1.3.5.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白提取按照Lefevre等[28]的方法并進行適當修改。稱取4.00 g樣品，與緩沖液A（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含有100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH 7.0）按1∶10（m/V）混合均勻，15 000 r/min勻漿60 s，6 000 r/min、4 ℃離心10 min，取沉淀。再加入5 倍體積緩沖液A，相同條件下離心取沉淀。重復以上操作2 次，最后沉淀中加入緩沖液B（25 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含有0.6 mol/L NaCl，pH 7.0），勻漿后冰浴溶解2 h，過濾去除不溶性部分，濾液即為肌原纖維蛋白溶液。以牛血清白蛋白作標準曲線，考馬斯亮藍法測定蛋白質量濃度，并用緩沖液B調節蛋白質量濃度。

1.3.5.2 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜

參照Laemmli[29]的方法，并加以調整。向一定質量濃度的肌原纖維蛋白樣品中加入緩沖液B，使各蛋白樣品的最終質量濃度一致，加1×上樣緩沖液，沸水浴5 min。上樣量為10 μL，選擇恒壓條件，4%濃縮膠恒壓80 V條件下進行電泳，待樣品進入12%分離膠后，調節電壓至120 V，繼續電泳，直到溴酚藍跑至凝膠底部，關閉電源。將膠取出，加入適量的考馬斯亮藍染色液R250，染色30 min。染色完畢后，回收染色液，加入適量脫色液，置于搖床脫色過夜，直至凝膠上的背景色完全脫去。

1.3.5.3 解凍處理后蛋白的熒光光譜分析

將肌原纖維蛋白溶液稀釋至0.1 mg/mL，運用熒光分光光度計在室溫25 ℃環境下進行樣品的熒光掃描測定，采用1 cm光徑的四面透光的石英比色皿，出射和入射的狹縫寬度均為5 nm。樣品在280 nm波長處被激發，290～500 nm發射波長下進行掃描測定；以磷酸鹽緩沖溶液作為空白對照。

1.3.5.4 對蝦肌肉蛋白熱穩定性測定

對蝦去頭去殼后，取第二腹節處約15 mg左右的肌肉，平鋪于DSC儀鋁質樣品盤中，用配套鋁蓋壓蓋密封處理，需稱量記下蝦肌肉樣品的精確質量，以空白鋁盤作為對照。DSC儀工作條件為：N2（99.99%純度）流速40 mL/min；20 ℃平衡2 min。以5 ℃/min的升溫速率從20 ℃升溫至100 ℃，記錄該升溫范圍內的吸熱變性曲線。用與DSC儀連接的TA Universal分析軟件來探究解凍處理對蝦肉肌肉蛋白DSC圖譜各峰的變性溫度以及變性焓的影響。

1.4 數據處理

每次測定至少設置3 次平行，測定結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 20軟件進行數據分析，采用ANOVA進行鄧肯氏（Duncan）差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 對蝦解凍的數值模擬結果

2.1.1 對蝦在解凍過程中最大截面處的溫度分布

圖4 不同解凍時間的切面溫度場Fig.4 Internal cross-sectional temperature fields at different thawing times

對蝦解凍所需的熱量以超聲衰減產熱和與介質的熱交換為主，取解凍10、48、100、146 s時對蝦最大截面處的溫度分布來觀察。超聲輔助解凍和靜水解凍時對蝦溫度分布如圖4所示。由模擬結果可知，解凍到10 s時，對蝦與介質水發生劇烈的熱交換，其邊緣部分迅速升溫，而內部溫度依舊較低；超聲輔助解凍的對蝦內部整體溫度高于靜水解凍組，且低溫區的面積小于靜水解凍組的低溫面積。解凍到48 s時，對蝦表面的溫度依舊升高得較快，超聲輔助解凍的對蝦整體進入相變區，最低溫度為－5 ℃，低溫區在逐漸減少；靜水解凍的對蝦邊緣升溫迅速，但內部低溫區的面積仍然較大，熱量由外向里逐漸傳導。當解凍到100 s時，超聲輔助解凍的對蝦僅一小片區域處于相變區；靜水解凍的對蝦解凍完成區域從邊緣到中心逐漸增加，但中心的一大片區域仍處于相變階段。解凍至146 s時，超聲輔助解凍的對蝦最低溫度達到－1 ℃，解凍完成；而靜水解凍的對蝦中心部分仍處于相變區，根據計算結果可知，當解凍至208 s時，才完成解凍。由此可知，超聲輔助解凍過程中，一方面對蝦內部組織吸收超聲衰減所產生的能量從而加速解凍進程；另一方面超聲促進對蝦與介質的熱交換，因而解凍速率顯著大于靜水解凍組。

2.1.2 實驗驗證

圖5 超聲輔助解凍（A）和靜水解凍（B）時中國對蝦中心溫度模擬值和實測值對比Fig.5 Comparison of measured and simulated values of internal temperature of Chinese shrimp during ultrasound-assisted thawing (A)and water immersion thawing (B)

為了判斷COMSOL軟件模擬的準確性，本研究設計實驗來進行驗證。如圖5A所示，超聲輔助解凍時，COMSOL軟件計算得到的中心溫度達到－1 ℃所需時間為146 s，實驗測得的時間為132 s，較為接近。在解凍的整個階段，模擬值與實驗值擬合較好，RMSE為0.943 3 ℃。圖5B是對照組靜水解凍中心溫度實驗值和模擬值的對比，計算得到的中心溫度到達－1 ℃所需時間為208 s，實驗測得的時間為206 s，較為接近，RMSE為0.907 7 ℃。結果表明，COMSOL軟件模擬能較好地反映超聲輔助解凍過程中溫度分布和變化趨勢，本模型具有一定的精確性。

同時可以看出，超聲輔助解凍的解凍速率遠遠大于對照組，解凍時間縮短了35.9%；尤其在相變期，超聲輔助解凍能快速通過此階段，降低對凍藏食品品質的損害，是一種快速有效的解凍方式。

2.2 解凍處理對對蝦蛋白品質的影響

2.2.1 解凍處理對對蝦肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

圖6 中國對蝦肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of Chinese shrimp myofibril proteins

SDS-PAGE圖譜常用來表征蛋白質的聚集或裂解變性情況。電泳圖譜的主要條帶包括分子質量為220 kDa的肌球蛋白重鏈、43 kDa的肌動蛋白、36 kDa的原肌球蛋白[30]。如圖6所示，解凍處理后肌球蛋白重鏈與肌動蛋白同鮮樣對照組無顯著性差異，表明在肌原纖維蛋白中，解凍處理對這幾種主要蛋白沒有明顯的影響。與鮮樣對照組相比，解凍后分子質量為70～100 kDa的蛋白條帶顏色輕微地變淺或加深，表明蛋白發生一定程度的降解和交聯；這主要是在凍結、解凍解凍過程中，蛋白質受自身蛋白酶和細菌蛋白酶的共同作用發生分解所引起的[31]。

2.2.2 解凍處理對對蝦肌原纖維蛋白熒光色譜的影響

圖7 解凍處理對對蝦肌原纖維蛋白內源熒光的影響Fig.7 Effect of thawing treatment on the intrinsic fluorescence intensity of shrimp myofibrillar protein

蛋白的內源熒光主要來自于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基，常作為內源熒光探針來研究溶液狀態下蛋白質的構象[32]。蝦肉肌原纖維蛋白經解凍處理后其內源熒光強度的變化如圖7所示，解凍處理對肌原纖維蛋白的最大吸收波長沒有發生顯著性改變，均為336 nm，未檢測出肌原纖維蛋白熒光發射峰的紅移或藍移現象，說明Trp和Tyr殘基微環境極性沒有發生明顯變化。但解凍后肌原纖維蛋白的熒光強度顯著上升，熒光強度的增加主要由于蛋白質疏水殘基的暴露，即肌原纖維蛋白的Trp部分展開[33]。這表明解凍處理對蛋白的高級結構有一定的影響，使得蛋白構象發生變化，讓更多的發色基團暴露；尤其是靜水解凍，對蛋白構象影響較大。

2.2.3 解凍過程對對蝦肌肉蛋白熱穩定性的影響

表2 解凍處理對中國對蝦蝦肉蛋白熱穩定性的影響Table2 Influence of thawing treatment on thermal stability of Chinese shrimp muscle

表2顯示了解凍過程對蝦肉峰I、峰II、峰III變性溫度和變性焓值的影響。解凍后蝦肉蛋白峰I的變性焓值有一定程度的下降，但沒有顯著性變化；峰II的變性溫度均顯著性上升，變性焓無顯著性變化；峰III的變性焓值下降，尤其是靜水解凍后的蝦肉蛋白，變性焓顯著性下降。因此可知，解凍處理對蝦肌肉蛋白的熱穩定性影響較小，超聲輔助解凍由于具有較快且較為穩定的特點，解凍后的蝦肉蛋白熱穩定性接近鮮樣，蛋白變性程度低，靜水解凍后蛋白熱穩定性降低。其中肌漿蛋白對解凍處理有較強的穩定性，由于其較穩定的結構特點，解凍不會導致其徹底變性，只會降低其變性溫度；而肌動蛋白則較易受到影響，變性程度較大。

3 結 論

和傳統解凍方式相比，超聲輔助解凍展現出了較高的工業價值，能顯著提高解凍速率的同時并較好地保持食品的品質。利用COMSOL軟件對超聲輔助解凍過程進行數值模擬，模擬值和實驗值較為接近，其中超聲輔助解凍的RMSE為0.943 3 ℃，對照組的RMSE為0.907 7 ℃，驗證了模型的準確性；且超聲輔助解凍的時間比對照組縮短了35.9%。

解凍處理后，對于蛋白的一級結構來說，占主要成分的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白沒有發生變化，但有一部分蛋白條帶顏色變淺或加深，發生輕微的降解或聚集。從熒光光譜來看，最大吸收波長均無顯著變化，但熒光強度均一定程度增加，尤其是靜水解凍后，熒光強度增加幅度較大，造成肌原纖維蛋白的Trp殘基較多暴露。超聲輔助解凍后，對蝦肌肉的熱穩定性接近鮮樣，而靜水解凍后，其肌動蛋白的變性焓值顯著下降，熱穩定性變差。

綜上所述，相較于靜水解凍，超聲輔助解凍對蝦是一種高效的解凍方式，在快速解凍的同時能較好地保持中國對蝦的品質，這種解凍方式值得更深一步的研究。