中國野生菰米對大鼠血脂及炎性因子表達的影響

王 菁，劉 洋，張 紅，王少康*，孫桂菊

（東南大學公共衛生學院營養與食品衛生系，江蘇 南京 210009）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指一系列的病理和臨床表現，是由于機體的靶器官及靶組織對內源性和/或外源性胰島素的敏感性和反應性降低或喪失而產生的[1]。IR是導致2型糖尿病發生的初始原因，同時也是多種慢性代謝性疾病發病的基礎[2]，因此，防治慢性代謝性疾病的關鍵之一是改善IR的狀態[3-4]。同時，IR的發生往往還會升高炎性因子水平[5]。有研究表明，發生IR的誘導因素是炎癥，炎性因子的聚集可能會干擾胰島素信號的轉導途徑[5-7]，但是如何通過干預炎性因子改善IR的作用和機制仍需進一步研究。本研究以總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）[8-9]濃度及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、高敏C反應蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）以及白介素-6（interleukin-6，IL-6）含量為評價指標，采用中國野生菰米對高脂膳食誘導的IR模型大鼠進行干預，探究其對血脂濃度及炎性因子水平的影響，探討我國野生菰米通過降低炎性因子水平從而改善高脂膳食誘導產生的IR作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

5 0 只近交系雄性S P F級S D大鼠，體質量180～220 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（滬）2008-0016。在SPF級實驗室內對動物進行單籠飼養，自由攝食和飲水，將室內溫度控制在18～25 ℃，保持相對濕度為50%～70%及干燥、安靜的通風環境，光照周期設定為12 h。

中國野生菰米（Zizania latifolia）采自江蘇省宿遷市駱馬湖，菰米經日光曬干，手工搓去外殼，粉碎過60 目篩制成菰米粉。對照樣品為市售大米和面粉。TC、TG、HDL-C、hs-CRP、IL-6、TNF-α、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰島素（fasting insulin，FINS）試劑盒 上海基爾頓生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

酶標儀 芬蘭Labsystems公司；WF130萬能粉碎機上海魔速科學器材有限公司；80-2型離心機 上海醫療器械廠有限公司；可調節移液器 大龍醫療設備儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 飼料配方

使用完全配方飼料。以美國營養學會推薦的AIN-76M實驗動物合成飼料為陰性對照組飼料，在此基礎上對蛋白質和蔗糖的比例進行適當調整，增加膽固醇和飽和脂肪酸質量，制備成IR模型組飼料（高脂飼料）[10]；同時用面粉、粳米粉替代高脂飼料中的淀粉和蔗糖，配制成米面組飼料；使用菰米替代高脂飼料中淀粉和蔗糖，配制成高劑量菰米組飼料；使用50%菰米和50%精米、面替代高脂飼料的淀粉和蔗糖，配制成低劑量菰米組飼料[11]。具體配方見表1。

表1 5 組實驗動物飼料配方的構成Table1 Formulation and composition of five experimental diet

1.3.2 動物分組

適應性喂養1 周后，將受試大鼠按照HOMA穩態模型IR指數（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR）（按式（1）計算）進行隨機分組，分別為陰性對照組、高劑量菰米組、低劑量菰米組、米面組及IR模型組，10 只為1 組，分別飼喂與其相對應的飼料，實驗周期為8 周。在實驗初期所給予的飼料量低于適應性喂養時10%～20%，每天按時喂養，單籠飼養。每周稱量并記錄大鼠的體質量以及飼料的消耗量。實驗結束時將動物禁食不禁水12 h之后處死，麻醉后采用股動脈取血，將血清分離（3 000 r/min離心10 min），保存在－20 ℃冰箱內，在－80 ℃冰箱中貯存大鼠的小腸及肝臟組織以備用。FBG濃度采用葡萄糖氧化酶法，在2 h內測定；FINS水平采用胰島素放射免疫沉淀法，根據試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 檢測指標

血脂濃度（TC、TG及HDL-C濃度）的測定：采用Enzymatic-trinder法測定TC濃度（c（TC））；甘油磷酸氧化酶法測定TG濃度（c（TG））；膽固醇氧化酶法測定HDL-C濃度（c（HDL-C）），根據試劑盒說明書進行操作。LDL-C濃度（c（LDL-C））用Friedewald公式（式（2））[12]計算。

hs-CRP含量的測定采用雙抗夾心酶聯免疫吸附測定法；TNF-α含量的測定采用放射免疫分析方法；IL-6含量的測定采用放射免疫分析方法，根據試劑盒說明書進行操作。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 中國野生菰米對大鼠生理情況的影響

實驗過程中，各組動物毛色、精神狀況良好，攝食、攝水狀況正常。每只大鼠控制攝食量為20 g/d。在實驗初期，各組大鼠間體質量并沒有顯著差異（P＞0.05）。隨著實驗時間的延長，各組大鼠的體質量均慢慢增長，在實驗結束時：陰性對照組大鼠的體質量顯著低于IR模型組（P＜0.05）；米面組和IR模型組大鼠的體質量顯著高于高劑量菰米組和低劑量菰米組（P＜0.05）；高劑量菰米組大鼠體質量與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05）；低劑量菰米組大鼠體質量高于陰性對照組和高劑量菰米組，但無顯著性差異（P＞0.05）；米面組大鼠體質量與IR模型組相比較為接近（表2）。

表2 不同飼料飼養對各組大鼠體質量的影響Table2 Effect of different feeds on body mass of rats

2.2 中國野生菰米對大鼠血糖水平和IR的影響

根據中國野生菰米對高脂膳食誘導大鼠IR機制的相關研究可以發現：在第2周時，FBG濃度、FINS水平和HOMA-IR均沒有差異，在第4周時可能產生差異[11]；因此本實驗從第4周時開始檢測大鼠血糖水平。實驗開始時，各組大鼠FINS水平以及血清FBG濃度無明顯差異。實驗末期，IR模型組血清FBG濃度、FINS水平及HOMA-IR顯著高于陰性對照組（P＜0.05）；與IR模型組和米面組比，低、高劑量菰米組血清FBG濃度和FINS水平、HOMA-IR顯著降低（P＜0.05）；低劑量菰米組血清FBG濃度和FINS水平、HOMA-IR高于高劑量菰米組，但無顯著性差異（P＞0.05）；米面組血清FBG濃度和FINS水平與模型組比無顯著性差異（P＞0.05）（表3～5）。

表3 不同飼料飼養對各組大鼠血清FBG濃度的影響Table3 Effect of different feeds on FBG levels in rats

表4 不同飼料飼養對各組大鼠FINS水平的影響Table4 Effect of different feeds on FINS levels in rats

表5 不同飼料飼養對各組大鼠HOMA-IR的影響Table5 Effect of different feeds on HOMA-IR in rats

2.3 中國野生菰米對大鼠血脂濃度的影響

表6 不同飼料飼養對各組大鼠血脂濃度的影響Table6 Effects of different feeds on blood lipid levels in rats

由表6可知，IR模型組大鼠TG、TC、LDL-C濃度與陰性對照組相比顯著升高，HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）；高、低劑量菰米組TG、TC、LDL-C濃度與IR模型組和米面組相比顯著降低，HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），且與陰性對照組差異不顯著（P＞0.05）；低劑量菰米組TG、TC、LDL-C濃度高于高劑量菰米組，HDL-C濃度低于高劑量菰米組，但是差異不顯著（P＞0.05）；米面組與IR模型組相比血脂濃度接近（P＞0.05）。

2.4 中國野生菰米對大鼠小腸、肝臟組織勻漿炎性因子水平的影響

表7 不同飼料飼養對各組大鼠小腸組織勻漿炎性因子水平的影響Table7 Effect of different feeds on inflammatory factor levels in small intestinal tissue homogenate of IR rats

表8 不同飼料飼養對各組大鼠肝臟組織勻漿炎性因子水平的影響Table8 Effect of different feeds on inflammatory factor levels in liver tissue homogenate of IR rats

從表7、8中可知，與陰性對照組相比，IR模型組和米面組hs-CRP、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05），低、高劑量菰米組hs-CRP含量也有所升高，但不顯著（P＞0.05）；與米面組相比，低、高劑量菰米組的hs-CRP、TNF-α含量未見明顯下降，其中高劑量菰米組較低劑量菰米組hs-CRP含量較低，但差異無顯著性（P＞0.05）；與IR模型組相比，高劑量菰米組的TNF-α含量顯著下降（P＜0.05）。與陰性對照組相比，低、高劑量菰米組、IR模型組和米面組IL-6含量顯著升高（P＜0.05）；與IR模型組相比，低、高劑量菰米組的IL-6含量顯著下降（P＜0.05）；與米面組相比，高劑量菰米組IL-6含量顯著下降（P＜0.05），低劑量菰米組IL-6含量有所下降，但不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 高脂膳食誘導IR動物模型的建立

本研究在AIN-76M動物合成飼料配方的基礎上對蛋白質和蔗糖的比例進行了適當調整，增加飽和脂肪酸和膽固醇的含量，制成誘導大鼠IR的高脂飼料[13]。在第4周時，與陰性對照組相比，IR模型組大鼠的血清FBG濃度、FINS水平及HOMA-IR均顯著偏高，這與Efendi?等[14]使用雄性Wistar大鼠建立IR模型的結果一致。表明IR大鼠模型可以通過高脂膳食的誘導建立。

3.2 中國野生菰米對大鼠血脂濃度的影響

經過8 周的造模和膳食干預，IR模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C濃度均顯著高于陰性對照組，HDL-C濃度顯著低于陰性對照組；米面組大鼠血清FBG濃度和血脂濃度與IR模型組接近；與IR模型組和米面組相比，高劑量菰米組大鼠的血清TC、TG和LDL-C濃度均顯著降低，HDL-C濃度顯著升高，且和陰性對照組相當；低劑量菰米組大鼠血清TC、TG和LDL-C濃度略高于高劑量菰米組和陰性對照組。

本研究表明，中國野生菰米可以明顯改善高脂膳食誘導的IR大鼠的血糖以及血脂代謝紊亂情況，使得大鼠的血糖濃度和血脂濃度維持在正常的范圍內，增強SD大鼠的胰島素敏感性，改善其IR狀態，但是精米、面并沒有起到預防、改善的作用。高劑量菰米組效果要略好于低劑量菰米組，但差異無顯著性。說明用菰米替代50%的精米、面就能改善高脂膳食誘導的大鼠糖、脂代謝異常。

菰米改善糖、脂代謝的原因可能和菰米富含生物活性成分有關。在中國野生菰米中含有大量的生物活性物質，例如抗性淀粉、黃酮、酚類、花色苷、皂苷、植物甾醇、多不飽和脂肪酸、生育酚等[15-17]，通過這些生物活性物質之間的協同或相加作用對高脂膳食誘導的IR大鼠胰島素敏感性以及糖、脂代謝水平有所改善[18-19]，在菰米中存在的抗性淀粉的含量比精制的米、面高，平均每100 g菰米中含有11.73 g抗性淀粉，有研究顯示抗性淀粉能夠降低胰島素反應及餐后血糖濃度，也能夠改善機體胰島素敏感性[20]。菰米中的膳食纖維含量是普通米、面的2.4 倍，100 g菰米中總膳食纖維質量為7.24 g[20-21]，這對血脂濃度的降低也有一定作用[22]。此外，菰米中的色素質量分數為5%，屬于花色苷類化合物，此類物質能夠調節血脂代謝，提高機體的抗氧化能力，從而可能改善脂代謝紊亂的情況。這些都體現出我國野生菰米具有重要的營養保健價值，但其具體的生物活性物質以及相關的機制仍然需要進一步研究。

3.3 中國野生菰米對大鼠炎性因子的影響

近些年來，有相關研究及流行病學資料證實，IR與炎癥之間應該存在著相關性，由此可以推斷出炎癥可能是使得IR發生的一個重要因素[23]，而炎性因子干擾胰島素受體底物的信號轉導通路則是導致IR發生的主要分子機制[5-6]。有研究證實，肥胖、IR以及代謝紊亂都是一種低度炎癥的狀態；“系統性炎癥”或者是“慢性低水平的炎癥”就是指代謝性疾病的炎癥狀態，其被認為是由于營養過剩而誘發的一種長期的炎性反應。目前的研究顯示，代謝綜合征人群血漿中炎性因子水平明顯升高，例如在高血脂、高血壓、2型糖尿病、動脈粥樣硬化及肥胖患者的血漿中，IL-6和TNF-α水平都有明顯的升高[23-24]，TNF-α表達水平在肥胖模型動物的血漿里也有明顯的升高[25]，這些結果都說明炎性因子參與了IR的形成[26]。已有大量證據證明TNF-α參與了IR的形成，在IR的發病機制中起重要作用[27]。由肝臟分泌產生的重要防御分子hs-CRP，同時也是全身炎癥反應的敏感性標志物[28]。hs-CRP通過介導促炎因子IL-1、IL-6的產生從而引起IR；其也可通過促進TNF-α的釋放從而抑制胰島素信號轉導，導致IR的形成[26]。

本研究中，IR模型組大鼠小腸TNF-α、hs-CRP和IL-6含量均顯著高于陰性對照組，說明在IR狀態下，小腸存在炎性狀態，將進一步誘導小腸產生IR；米面組雖然略低于IR模型組，但沒有顯著性差異（P＞0.05），說明米、面不能改善IR狀態下小腸低度炎性水平。菰米對降低這些炎性因子水平有一定的作用，其可以使脂肪組織所分泌產生的炎性因子TNF-α含量減少，使hs-CRP的合成受到抑制，從而使小腸低度的炎癥狀態得到緩解。菰米可以通過減少脂肪的蓄積降低體質量，從而減少炎性因子的分泌，同時還可能通過升高HDL-C濃度以及降低TG、TC、LDL-C濃度使內皮損傷減輕，從而進一步使慢性炎癥的狀態得到減輕。因此，炎癥機制可能成為IR發生機制中的一個重要的研究方向，但如何有效地對炎性因子進行干預從而改善IR仍有待研究。

綜上，中國野生菰米可以通過降低血糖濃度、調節血脂代謝紊亂情況，從而使高脂膳食誘導的大鼠IR作用得到改善。同時，其可以通過調節炎性因子的表達、緩解機體的炎癥狀態，從而改善高脂膳食誘導大鼠的IR作用。