海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜的制備及特性

焦欣欣，趙 雷，王 凱，胡卓炎*

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

由于消費者不斷地關注如何預防食品腐敗，同時也慢慢傾向于使用天然的可降解生物材料，因此研究人員對天然大分子物質制備的膜材料越來越感興趣[1]。涂膜保鮮有助于防止物理損傷、增強外觀觀賞性和減少微生物生長，可以成為一種節約成本的綠色保鮮方式[2]。可降解生物材料主要是蛋白質、多糖、脂質或這些物質的結合物[3]。在這些生物聚合物中，海藻酸鈉具有良好的生物相容性和生物降解性，在Ca2+存在下形成凝膠，并在凝膠中捕獲其他材料，可用于開發新型生物材料[4-6]。但是海藻酸鈉有熱穩定性較低和機械強度較差等缺點，現已有研究顯示，海藻酸鈉與其他聚合物混合可改善其性質[7]。明膠是具有良好的親和力、兼容性、成膜性能[8]、機械性能和阻氣性能的薄膜和涂層，可以在低相對濕度條件下具有良好的光學性能，能夠用作生物包裝材料[9]。海藻酸鈉和明膠共混膜在食品領域已有應用于蔬菜、水果的保鮮研究，且可以通過添加抗氧化抑菌物質來提高海藻酸鈉-明膠的保鮮效果[10]。

鞣花酸是一種天然的多酚類物質，廣泛存在于多種藥用植物及其果實中，具有良好的抗氧化、抗菌、抗衰老、抗癌癥性能[11-12]。鞣花酸與殼聚糖制成的共混膜具有良好的機械性能和抗氧化抑菌性能[13]。Kim等發現鞣花酸質量分數分別為0.5%和1.0%的殼聚糖-鞣花酸膜通過誘導細胞凋亡對黑素瘤細胞具有明顯的抗增殖作用，能顯著抑制腫瘤組織和癌細胞生長[14-15]。

本研究采用溶液共混法，在海藻酸鈉-明膠成膜體系中添加鞣花酸制備一種共混膜，通過評價共混膜的物理性能、抗氧化活性和抑菌性，為海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜在果蔬涂膜保鮮中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉（sodium alginate，SA） 河南思遠生物科技有限公司；明膠（gelatin，G） 上海潤捷化學試劑有限公司；鞣花酸（ellagic acids，EA）（分析純） 上海阿達瑪斯試劑有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌由華南農業大學食品學院微生物實驗室保存。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MIR-254-PC電熱恒溫干燥培養箱 廣州深華生物技術有限公司；SW-CJ-IFD潔凈工作臺 蘇州泰安空氣技術有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋 上海宜川上嶺儀表有限公司；Vertex傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 美國BRUKE公司；Merlin高分辨場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 共混膜的制備

據Liu Sijun等的研究，海藻酸鈉和明膠的質量比在2∶1左右時共混膜的性能最優，但由于海藻酸鈉成膜性差，通常在共混膜中加入甘油來增加共混膜的機械性能[7]。鞣花酸溶解性差，只溶于堿和吡啶。考慮到制備的共混膜擬用于食品保鮮，故選擇0.1 mol/L NaOH溶液配制鞣花酸溶液。由預實驗的結果得出，成膜性較好的條件是海藻酸鈉、明膠、鞣花酸的質量比為10∶5∶3。稱取質量分數為1.5%的海藻酸鈉和明膠，加入蒸餾水，在60 ℃下磁力攪拌直至完全溶解，再用0.1 mol/L NaOH溶液配制質量分數為0.067%的鞣花酸溶液。將配制好的海藻酸鈉溶液、明膠溶液、鞣花酸溶液按設計的比例混合在一起，加入質量分數1%的甘油，25 ℃下磁力攪拌30 min，用0.1 mol/L HCl溶液調節pH值。取20 mL共混膜液倒在培養皿中，干燥箱45 ℃干燥，冷卻后揭膜，在25 ℃和相對濕度53%環境中平衡48 h。共混膜體系制備條件如表1所示。

表1 共混膜體系的制備條件Table1 Preparation conditions for different blended films

1.3.2 共混膜的特性分析

1.3.2.1 共混膜的厚度測定

根據湯秋冶等[16]的方法，共混膜的厚度通過手持式螺旋測微器測定，精度為0.001 mm。在膜上測定4 個頂點和中心點的厚度，取平均值即得膜的厚度。

1.3.2.2 不透明度測定

參考Li Jianhua[17]和石偉健[18]等的方法，在600 nm波長處使用紫外-可見分光光度計測定膜的吸光度。將樣品切成矩形片（1 cm×4 cm）貼在比色皿表面，并直接放入分光光度計中進行測試，使用空的比色皿作為空白對照。以不透明度評價膜的光屏障性能，不透明度的計算按照公式（1）進行。

式中：A600nm為共混膜在600 nm波長處的吸光度；L為共混膜的厚度/mm。

1.3.2.3 水分質量分數和水溶性測定

采用質量損失法測定共混膜的水分質量分數和水溶性[19-20]。共混膜樣品在相對濕度53%、25 ℃下平衡48 h，直到達到恒質量m1，在105 ℃的烘箱中干燥至恒質量m2。共混膜的水分質量分數的計算如方程（2）所示。

將膜樣品放在30 mL蒸餾水中24 h，取出共混膜并擦去膜表面水分后，將殘留的膜樣品再次放入105 ℃的烘箱中干燥24 h，確定最終共混膜的干質量m3。共混膜水溶性的計算如公式（3）所示。

1.3.2.4 WVP測定

水蒸氣透過系數（water vapour permeability，WVP）采用杯式法并略有改進[21]，膜片被固定在含3.0 g無水氯化鈣（相對濕度0%）的小測試杯杯口，稱質量后的測試杯被放入到裝有飽和氯化鈉溶液（相對濕度75%）的干燥器中，保持膜內、外兩側有一定的蒸汽壓差，每隔1 d取出稱質量一次，直至質量變化小于0.001 g，樣品每組做3 次重復。按式（4）計算WVP。

式中：m為透過膜的水分質量/g；L為膜片的厚度/m；A為膜的有效面積/m2；t為水分透過的時間/s；ΔP為膜兩側水分蒸汽壓差/Pa。

1.3.2.5 DPPH自由基清除率測定

參照Li Jianhua[17]和Samart[22]等的方法并稍作改動，稱取0.1 g共混膜置于50 mL蒸餾水中浸泡2 h，制得共混膜浸泡液，將3 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液與1 mL共混膜浸泡液混合，將混合液放入暗室反應30 min，在517 nm波長處測吸光度。

式中：ADPPH為在517 nm波長處DPPH-乙醇溶液的吸光度；AS為在517 nm波長處共混膜溶液的吸光度。

1.3.2.6 抑菌性測定

以抑菌圈直徑評價共混膜的抑菌性能，參照Liakos[23]和Ne?i?[21]等的方法并略作改動。將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種到固體培養基中，在培養箱中37 ℃培養24 h。從培養皿中挑取單菌落，加入到20 mL液體培養基中，37 ℃、130 r/min搖床培養24 h。無菌水稀釋10 倍后作為初始菌液。

吸取0.1 mL初始菌液加到固體培養基中，進行平板涂布。每個培養皿中均勻地放置3 個牛津杯（10 mm×7.8 mm×6 mm），并向牛津杯中加入0.15 mL配制好的共混膜液。把培養皿放入37 ℃的培養箱中培養24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.3.2.7 FTIR分析

收集方式為水平衰減全反射（attenuated total refraction，ATR）模式，ATR的晶體材料為ZnSe。用FTIR儀對共混膜進行FTIR掃描，掃描范圍為4 000～600 cm－1，掃描次數32 次，分辨率4 cm－1。以空ATR晶體的FTIR譜圖為背景。

1.3.2.8 SEM觀察

將干燥后的膜樣品噴金后，用Merlin高分辨場發射SEM觀察共混膜的表面形貌。

1.4 數據分析

實驗重復3 次，數據取3 次測定結果的平均值，利用Duncan’s新復極差檢驗評價樣品平均值之間的差異顯著性，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 共混膜的不透明度結果分析

圖1 5 種不同共混膜體系的不透明度Fig.1 Opacity of five different blended films

食品保鮮膜通常需要保護食物免受光線的影響，不透明度高可增強膜的光屏障性能。由圖1可以看出，在pH 9.0時，海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜（D）的不透明度最高，為15.54；在pH 6.5時，海藻酸鈉-明膠共混膜（A）的不透明度最低，為5.66；5 種混合膜的不透明度存在顯著性差異。與海藻酸鈉-明膠共混膜相比，添加鞣花酸可以明顯改善共混膜的光屏障性能，這說明添加鞣花酸對共混膜的不透明度有顯著的影響，可能是因為添加鞣花酸會使共混膜的顏色加深、結構更加緊密。pH值對共混膜的不透明度也有顯著的影響，在堿性條件下，共混膜的不透明度較高。堿性條件和加入鞣花酸都會改變共混膜中氫鍵和氨基的作用，使共混膜的結構改變。

2.2 共混膜的厚度、水分質量分數、水溶性、WVP結果分析

表2 5 種不同共混膜體系的厚度、水分質量分數、水溶性和WVP Table2 Thickness, moisture content, water solubility and WVP of five different films

表2顯示，5 種共混膜的水分質量分數在0.55%～0.85%之間，均沒有顯著差異。這是因為鞣花酸屬于疏水性物質，其添加量對共混膜的水分質量分數沒有顯著性影響。在水溶性方面，5 種共混膜都具有較低的水溶性，在被水浸泡24 h后還可以維持共混膜的完整性。其中，pH 6.5的海藻酸鈉-明膠共混膜（A）的水溶性最高，為0.91%；pH 9.0的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜（D）的水溶性最低，為0.38%。可能原因是海藻酸鈉、明膠、鞣花酸能交聯在一起，且海藻酸鈉和鞣花酸都是疏水性物質，水分很難進入共混膜結構。WVP的結果表明，除pH 9.0的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜（D）WVP較低（0.74×10－10g/（m·s·Pa））外，其他4 種共混膜的WVP在（0.91～1.05）×10－10g/（m·s·Pa）之間且沒有顯著性差異。這可能與共混膜的厚度有關，共混膜D的厚度最薄。

2.3 共混膜抗氧化性結果分析

圖2 5 種不同共混膜體系的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of five different films

DPPH自由基清除率是測定抗氧化性能的重要手段。圖2顯示，以海藻酸鈉-明膠為主的A、B膜樣品的DPPH自由基清除率分別為4.39%和2.41%，說明海藻酸鈉和明膠形成的共混膜抗氧化活性較差，改變pH值對其抗氧化活性影響不大。添加鞣花酸能提高共混膜對DPPH自由基的清除效果，其清除率最高可達到57.42%。這主要是因為鞣花酸本身就有很高的DPPH自由基清除能力和抑制脂質過氧化活性[24]，有研究表明，10 μg/mL鞣花酸的DPPH自由基清除率可以達到85%[25]。由于鞣花酸用0.1 mol/L NaOH溶液溶解，共混膜的堿性較大，因此采用0.1 mol/L HCl溶液調節共混膜的pH值。在堿性條件下海藻酸鈉-明膠-鞣花酸DPPH自由基清除率高于55.00%；而在中性體系中，海藻酸鈉-明膠-鞣花酸的DPPH自由基清除率只有20.44%，這是由于鞣花酸清除自由基的能力與苯氧自由基的穩定性呈正相關[26]，pH值會影響苯氧自由基與相鄰的羥自由基發生交換的穩定性，從而影響其抗氧化活性。

2.4 共混膜的抑菌性結果分析

表3顯示，5 種共混膜體系對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌）的抑制作用較強。從對3 種細菌的整體抑菌性來看，鞣花酸的添加和pH值的改變對不同共混膜體系的抑菌性有不同的影響。共混膜對大腸桿菌的抑菌性能中，除了pH 10.8的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜（C）稍差外，其他4 組沒有明顯差異，抑菌圈直徑在14.0 mm左右。共混膜對沙門氏菌的抑菌性能中，除了pH 7.0的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸（E）共混膜稍差外，其他4 組的抑菌性能沒有顯著性差異，抑菌圈直徑在12.5 mm左右。原因可能與沙門氏菌生長的最適pH值為7.2～7.4，在中性條件下活性較高有關[27]。另外，pH 11.5的海藻酸鈉-明膠共混膜（B）和pH 9.0的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜（D）對金黃色葡萄球菌的抑菌性能較好，抑菌圈直徑為12.5 mm左右。形成以上結果主要有兩個原因：在制作共混膜的過程中鞣花酸會有部分的損失；并且交聯作用會使酚類物質在膠體中的擴散速率變慢[28]。此外，海藻酸鈉和鞣花酸具有相似的抑菌機理，海藻酸鈉利用—COONa和—OH類活性基團抑制細菌生長，鞣花酸通過絡合菌體細胞的蛋白質和改變微生物生命活動需要的酶的分子結構抑制細菌生長并使細菌致死[29]。

表3 5 種不同共混膜體系的抑菌性能Table3 Antimicrobial activity of five different films

2.5 共混膜FTIR結果分析

圖3 5 種不同共混膜體系的FTIR譜圖Fig.3 FTIR spectra of five different films

由圖3可知，5 種共混膜的FTIR譜圖中都有海藻酸鈉和明膠的特征吸收峰。其中，明膠中3 285 cm－1左右的寬吸收峰為—OH與—NH的伸縮振動吸收峰疊加造成的，海藻酸鈉中1 404 cm－1左右的吸收峰是COO—的對稱伸縮振動吸收峰，923 cm－1左右的吸收峰是羧酸中O—H的特征吸收峰。另外，1 640 cm－1左右的吸收峰是C＝O反對稱伸縮振動吸收峰，1 553 cm－1左右的吸收峰是酰胺II帶（—NH彎曲振動）的吸收峰，1 025 cm－1左右的吸收峰是C—O—C的伸縮振動吸收峰，這些吸收峰都是海藻酸鈉和明膠吸收峰的疊加[30]。

在添加了鞣花酸后，從圖3中曲線C、D、E可見，都出現了1 370 cm－1和1 077 cm－1左右的吸收峰，均為鞣花酸的吸收峰[30]。同時從圖3可以發現，與膜樣品A相比，堿性條件（B）和加入鞣花酸（E）都會使—OH與—NH的伸縮振動吸收峰向高波數移動，這說明pH值的改變和鞣花酸的加入會破壞海藻酸鈉-明膠本身的氫鍵。與膜樣品A相比，其他4 組中酰胺II帶（—NH彎曲振動）的吸收峰強度明顯減小且向高波數移動，說明明膠中的氨基發生了變化。這些結果都說明了鞣花酸可以成功地與海藻酸鈉-明膠共混膜交聯，與2.1節結論相同。

2.6 共混膜表面形貌和微觀結構分析

圖4 5 種不同共混膜體系的表面形貌Fig.4 Morphology of five different films

從圖4可以看出，5 種共混膜的表面都較光滑、均勻，沒有孔洞和間隙，且都有柔韌性。5 種共混膜的顏色有差異，從圖4A、B可以看出，在酸性條件下，海藻酸鈉-明膠共混膜呈透明白色，在堿性條件下顏色偏黃。從圖4C～E可以看出，隨著堿性減弱，海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜的顏色由最初的明黃色逐漸加深，最后在中性條件下變成青色，這是因為在不同pH值條件下，鞣花酸溶液會有顏色的改變。

圖5 5 種不同共混膜體系的SEM圖（3 000×）Fig.5 SEM micrographs of five different films (3 000 ×)

SEM觀察可以很好地了解共混膜的均勻性和微觀結構。從圖5中可以看出，5 種共混膜都很致密，沒有任何顆粒狀多孔結構，說明海藻酸鈉、明膠和鞣花酸有一定的相容性。如圖5A、B所示，海藻酸鈉-明膠共混膜的表面形貌相對光滑、平整。但有少量氣泡和褶皺，可能是由于在制作的過程中沒有完全排除氣泡，以及干燥的過程中突然失水發生共混膜皺縮造成。觀察圖5C～E，發現隨著共混膜體系堿性減弱，鞣花酸與海藻酸鈉、明膠的相容性相對變差。如圖中箭頭所示，在pH 10.8時海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜可以形成很好的網絡結構，pH 9.0時共混膜發生聚集現象，pH 7.0時共混膜已經出現了結塊現象。但三者的微觀結構都沒有明顯的相分離，表明了混合結構的完整性。共混膜的微觀結構證實了海藻酸鈉、明膠、鞣花酸在共混膜中具有兼容性和混溶性。

3 結 論

采用溶液共混法制備5 種以海藻酸鈉-明膠為成膜基質的不同體系的共混膜并比較其特性。結果表明5 種共混膜都具有良好的光屏蔽性能、水蒸氣阻隔性能和低水溶性、低水蒸氣透過性等物理特性。鞣花酸的加入和pH值的改變可以提升共混膜的物理特性，其中pH 9.0的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜具有最高的不透明度（15.54）、最低的水溶性（0.38%）和WVP（0.74×10－10g/（m·s·Pa））。對于共混膜的功能特性，添加鞣花酸后共混膜的抗氧化性顯著提高，pH 9.0的海藻酸鈉-明膠-鞣花酸共混膜的DPPH自由基清除率最高，達57.42%。在抑菌性方面，添加鞣花酸對共混膜的影響不明顯，且改變pH值對共混膜的抑菌性影響也不明顯。膜結構方面，FTIR和SEM圖顯示鞣花酸可以與海藻酸鈉-明膠共混膜交聯，5 種共混膜的表面形貌都沒有孔洞和間隙；但隨著共混膜體系的堿性減弱，鞣花酸與海藻酸鈉、明膠的相容性也相對變差。