DNA分子熒光探針的種類及特點概述

張璐瑤 石曉明 杜亞丹 陳亞紅 楊志廣

(河南省周口師范學院化學化工學院 466001)

DNA作為遺傳信息的攜帶者和基因表達的物質基礎，在生物體的生長、發育、衰老、遺傳和變異等生命過程中起著極為重要的作用。因此，準確快速、專一性識別和檢測生物體內的DNA在生物醫學領域有著非常重要的意義。目前測定DNA的分析方法有很多種，其中熒光探針技術是一種借助熒光顯微鏡在分子水平上進行實時監測的重要技術手段，具有靈敏度高、選擇性好、可視性強、無損傷、操作方便，在生物學分析中受到了人們的廣泛關注和研究。因此，發現和合成新型多功能監測生物內DNA動態變化的熒光探針對于研究細胞的生理和病理過程具有十分重要的意義。本文主要分析了DNA分子熒光探針的研究現狀以及發展前景。

熒光探針與DNA分子之間主要有三種作用方式： 靜電作用、嵌插作用和溝槽作用。目前用于研究和測定DNA分子的熒光探針有很多種，主要包括有機熒光染料類、金屬離子類、金屬離子配合物類、納米粒子類和量子點類等DNA分子熒光探針。

1 有機熒光染料類熒光探針及其特點

有機染料是最早發展起來研究核酸的熒光探針，主要包括溴化乙啶、菁類染料、菲啶和吖啶類染料、中性紅、甲基藍以及氟化硼二吡咯(BODIPY)類染料等。這些有機熒光染料類熒光探針一般會與DNA分子發生較明顯的嵌插作用，使體系的熒光強度明顯增強，從而實現對DNA分子的檢測，進而分析小分子化合物與DNA之間的相互作用方式及作用機理。Zheng等[1]基于雙咔唑-菁染料設計合成了一個雙光子DNA熒光探針，該探針與DNA結合后，斯托克斯位移(Stokes shift)較大，雙光子熒光強度增強30倍，具有低毒性、良好的生物相容性和較強的細胞染色能力，能夠應用于活細胞DNA的雙光子生物熒光成像。Du等[2]基于BODIPY衍生物報道了一系列檢測DNA的熒光探針，這些探針靈敏度高、選擇性好、與DNA有較強的親和力，具有較好的活細胞DNA成像能力。

2 金屬離子類熒光探針及其特點

金屬離子主要涉及稀土離子，如Tb3+和Eu3+等，這是由于稀土離子與DNA具有很強的結合力，與DNA作用后能夠發射出稀土離子本身的特征熒光，具有光譜線寬窄、熒光壽命長、Stokes shift大等優良光學性能，可提供有關DNA及其組成的信息。Tong等[3]用溴化乙啶探針、紫外、熒光和圓二色光譜研究了百枯草與DNA的相互作用，證實Tb3+作為熒光探針與DNA鏈上帶負電荷的磷酸以靜電吸引的方式結合，對百枯草與DNA的結合具有明顯的抑制作用。

3 金屬離子配合物類熒光探針及其特點

由于金屬離子具有獨特的電子層結構、發射光譜窄、光化學穩定以及熒光壽命長等優點，因此得到了廣泛關注。利用金屬離子配合物熒光探針研究DNA可以從分子水平上探索DNA的結構、染色體變異、藥物的作用機理以及為新的藥物設計提供更有效的理論指導。根據發光體的差異可將金屬離子配合物熒光探針分為金屬離子發光的和配體發光的金屬配合物熒光探針。羅黎等[4]合成了氧氟沙星-Tb3+配合物熒光探針，利用熒光光譜、紫外光譜研究了DNA對氧氟沙星-Tb3+配合物體系的熒光增強效應。結果表明，DNA加入氧氟沙星-Tb3+配合物后，形成了氧氟沙星-Tb3+-DNA三元絡合物體系，熒光顯著增強，線性范圍為5.0×10-6～1.0×10-4mol/L，檢出限為1.7×10-6mol/L，選擇性好，與DNA的結合方式主要是溝槽式結合。楊歡春等[5]分別以La3+、 Eu3+、 Tb3+和Ce3+中心離子，合成了3-羥基-2-萘醛縮氨基硫脲稀土配合物，并通過紫外光譜、熒光光譜和黏度法等技術研究了配合物和DNA的相互作用模式。結果表明，配合物以插入的方式與DNA相結合。王凱等[6]以5-(4-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉和釕-菲羅啉衍生物為原料，合成了3種釕-菲羅啉卟啉化合物(Por1、 Por2和Por3)，并采用紫外光譜、熒光光譜和圓二色光譜測試了它們與DNA相互作用的方式。結果表明，Por1和Por2與DNA的結合方式均為凹槽的插入模式和外部結合共存，而Por3則采取自堆積的外部鍵合方式與DNA結合，該類配合物在光動力學治療中具有誘人的應用前景。Wang等[7]基于鄰菲羅啉衍生物設計合成了一類檢測線粒體DNA的雙光子金屬釕配合物熒光探針。該探針具有較好的雙光子吸收性能、良好的生物相容性、選擇性好、自發熒光小，實現了活細胞以及活組織中DNA的雙光子生物熒光成像，在生物過程中具有潛在的應用價值，為直接監測活細胞中的線粒體DNA提供了一個有潛力的研究平臺。

4 納米粒子類熒光探針及其特點

納米金由于其表面積大、穩定性好、易于制備、粒徑可控、良好的生物相容性以及獨特的光電特性等特點，在生物醫學領域得到了日益廣泛的應用。董曉婭等[8]以亞甲藍為電活性標記物，利用原位制備的納米金膜和穩定的Y型DNA設計合成了一種性能優異的DNA電化學生物傳感器。與傳統的傳感器相比，該傳感器具有選擇性好、背景電流小、線性范圍寬、抗干擾能力強等特點，另外，該傳感器也表現出了良好的重現性和穩定性。

5 量子點熒光探針及其特點

量子點熒光探針是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的能夠接受激發光產生熒光的半導體納米顆粒，粒徑在1～100nm間，具有尺寸效應、量子限域效應、表面效應、宏觀量子隧道效應等性質。而且量子點具有摩爾消光系數大、吸收波長寬且連續、熒光發射波長窄而對稱、Stokes shift大、光漂白作用小、光穩定好以及顏色可控等特點。因此，量子點作為生物標記物具有有機染料無法比擬的優勢。胡先運等[9]利用巰基丙酸包覆的InP@ZnS量子點與帶正電的Dured核酸染料通過靜電結合，構建了一種檢測DNA的熒光探針。通過熒光共振能量轉移機理(FRET)，Dured核酸染料-InP@ZnS量子點熒光產生淬滅效應，當Dured與DNA的特異性結合后，FRET過程被打斷，InP@ZnSQDs熒光恢復。該探針可用于模擬生物生理條件下的DNA檢測，具有選擇性好、檢測線性范圍寬、檢測限低等特點，為核酸的定量分析以及小分子藥物篩選開辟了新的途徑。

6 展望

DNA是生物體內重要的遺傳物質，實時準確地檢測細胞中DNA的含量對于某些疾病的診斷與治療具有重要意義。本文主要介紹了DNA分子熒光探針的研究現狀，雖然有很多種DNA熒光探針或檢測方法被報道，但還存在一些亟待解決的問題： ①開發專一性、熒光量子效率高、背景干擾小的DNA熒光探針；②開發具有水容性好、生物透膜性好、生物相容性好以及無毒性的DNA熒光探針；③合成具有高靈敏度、大雙光子吸收截面及大Stokes shift、能夠對活細胞和深層組織成像的雙光子DNA熒光探針；④加大探針與DNA分子之間的反應機理以及生物學機制研究，為生物研究和醫學診斷提供理論基礎。總之，在眾多科學工作者的努力下，DNA分子熒光探針將會獲得進一步發展，并在生命科學領域展現更加廣闊的應用用前景。