不同產地降香黃檀種子培育苗木葉片的抗寒性比較研究

張博宇，葛玉珍，韋宇靜，黎建楊，黃仕訓*

(1. 廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；2. 廣西大學林學院,廣西 南寧 530004)

【研究意義】降香黃檀(Dalbergiaodorifera)為蝶形花科黃檀屬常綠喬木，是重要的藥用觀賞植物，為國家二級保護植物，其木材為高級紅木，是很好的家具材料，被譽為“木中黃金”、“帝皇之木”。降香黃檀生長周期較長[1]，受氣候影響較大，又因其為熱帶陽性樹種，容易受到寒害凍害的威脅。如遭遇寒冬等極端惡劣氣候，將會影響其生長發(fā)育，降低其使用及利用價值。研究其不同產地抗寒性，對不同產地種子所培育苗木抗寒性進行對比，擴大不同產地種植區(qū)域，開展不同產地抗寒性研究將對降香黃檀的生產實踐具有指導意義。【前人研究進展】相關研究表明，適當?shù)牡蜏孛{迫有助于植物抗寒性的提高[2-4]。張毅龍等[5]的研究結果表明降香黃檀在低溫脅迫下凈光合速率及葉綠素含量下降。郭文福等[6]進行了降香黃檀北移試驗，結果表明適當北移對降香黃檀生長無過大影響。【本研究切入點】植物的抗寒性通常用電解質來表達[7]，本研究則通過不同產地降香黃檀種子所培育苗木葉片中相對電導率及游離脯氨酸、可溶性糖和丙二醛(MDA)的含量來進行表征。此外，目前對于降香黃檀的脅迫研究主要集中在干旱脅迫方面[8-11]，低溫脅迫研究相對較少，也鮮有抗寒性的相關報道。【擬解決的關鍵問題】收集8種不同產地的降香黃檀幼苗為試驗材料，研究在人工模擬自然逐漸降溫條件下其離體葉片的電導率變化，配合Logistic方程計算出半致死溫度(LT50)，并通過測定與植物抗寒性相關的生理生化指標，分析其耐寒性差異，以期為降香黃檀耐寒種質的選育提供實驗依據(jù)，為熱帶起源的降香黃檀的引種選育及合理安排生產布局提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在8個不同產地(海南尖峰嶺、海南儋州、福建仙游、福建福州、廣西桂林、廣西憑祥、廣東普寧和廣東肇慶)采集降香黃檀種子，于2016年3月播種于位于桂林的廣西植物研究所苗圃，采取常規(guī)措施培育苗木。2017年11月取生長勢基本一致的健康降香黃檀幼苗，選取其枝條中部葉片作為試驗材料。各產地的基本情況見表1。

1.2 低溫脅迫處理

將葉片采摘裝入自封袋，帶回實驗室后分別用自來水和蒸餾水沖洗后擦干，然后放入低溫培養(yǎng)箱中進行低溫處理。根據(jù)降香黃檀試驗所在地廣西桂林雁山的年均溫度(約20 ℃)、絕對低溫(-6 ℃)及降香黃檀的耐受低溫溫度[12-13]，設置5個處理溫度(4、0、-3、-6及-9 ℃)，以室溫(約20 ℃)作為對照。參考王冠群等[14]的低溫處理方法并稍做適當調整，當?shù)蜏嘏囵B(yǎng)箱溫度為4 ℃時，將試驗材料放入緩慢降溫，降溫速度為10 ℃·h-1，降至目標溫度后維持3h。材料取出后分析測定電解質滲出率，并進行脯氨酸、可溶性糖和丙二醛等生理指標的分析及鑒定，所有指標重復測定3次。

1.3 相對電導率的測定和半致死溫度(LT50)的計算

將對照和經(jīng)過處理的葉片拿出后，用濾紙吸干表面水分，避開主脈把葉片剪碎，快速稱取3份，每份1.0 g，放入試管中，加入20 mL去離子水，室溫下浸泡處理6 h。先用DDS-11A型電導儀測定葉片浸提液電導率，記為R1，然后將具塞刻度試管放入水浴鍋沸水浴30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率，記為R2，最后用去離子水的電導率Rck作為對照，計算相對電導率(REC)=[(R1-Rck)/(R2-Rck)]×100 %。

用SPSS統(tǒng)計分析軟件對不同處理溫度與葉片相對電導率之間的關系進行回歸分析，參考莫惠棟[15]、許瑛和陳發(fā)棣[16]、鄭曉翠等[17]、趙國富和張成磊[18]和徐海鴻等[19]的方法進行計算。用Logistic回歸方程y=K/(1+ae-bx)求得拐點溫度即半致死溫度(LT50)。式中y為相對電導率，x為對應的處理溫度，a、b為方程參數(shù)，K為相對電導率飽和值。將方程y=K/(1+ae-bx)轉化為ln[(K-y)/y]=lna-bx線性方程，令y*=ln[(K-y)/y]，則得到相對電導率(y*)與對應處理溫度(x)的直線方程，經(jīng)過線性回歸求出a、b，拐點溫度即半致死溫度(LT50)為-lna/b。

1.4 生理生化指標測定

降香黃檀離體葉片可溶性糖、游離脯氨酸(Pro)及丙二醛含量(MDA)含量的測定參考李合生[20]的方法，每個指標重復測定3次。

表1 不同產地環(huán)境概況

表2 低溫處理下不同產地降香黃檀葉片相對電導率比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。

Note: Data are mean±standard deviation, different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level, different uppercase letters represent significant differences at 0.01 level.

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003、SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，用LSD法檢驗不同處理間是否具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對不同產地降香黃檀葉片相對電導率的影響

由表2可知，在經(jīng)過一系列的低溫脅迫后，8個產地的降香黃檀葉片相對電導率隨著溫度的降低總體呈現(xiàn)上升趨勢，在降溫初期(20～-3 ℃)，8個產地葉片的相對電導率總體表現(xiàn)出緩慢小幅上升趨勢；當溫度降至-3～-6 ℃時，葉片相對電導率大幅增加；當溫度降至-6～-9 ℃時，葉片相對電導率變化有趨于穩(wěn)定的跡象，4和-6 ℃時無顯著差異(P>0.05，下同)。

從表2的變化幅度也可以看出，產自福建福州的葉片電導率變化幅度最小，在-9 ℃低溫脅迫下，只有產自福建福州的葉片的相對電導率保持在0.700以下的較低水平(0.659)。產自廣東肇慶、海南儋州及廣西憑祥的葉片電導率變化幅度較大，產自海南儋州的葉片在-9 ℃低溫脅迫下電導率達到0.833。

2.2 不同產地降香黃檀低溫半致死溫度(LT50)比較

由表3可知，Logistic方程擬合度均在0.930以上，說明方程擬合度結果可靠。半致死溫度的高低與抗寒性呈負相關，不同產地降香黃檀抗寒性存在一定的差異。根據(jù)表3，降香黃檀抗寒性強弱順序按照產地的排序如下：福建福州>廣西桂林>福建仙游>海南尖峰嶺>廣東普寧>廣東肇慶>廣西憑祥>海南儋州。

表3 低溫處理下不同產地降香黃檀葉片相對電導率方程及半致死溫度(LT50)

2.3 低溫處理對不同產地降香黃檀葉片生理指標的影響

由表4可知，8個產地的降香黃檀葉片中脯氨酸含量隨著溫度的降低總體呈先上升后下降的趨勢。溫度為0 ℃時，海南儋州所產葉片脯氨酸含量達到峰值，其他7個產地葉片脯氨酸含量則在-3 ℃時達到峰值。LT50最低的福建福州產地降香黃檀脯氨酸含量為89.37 ng·g-1FW。當溫度為20～0 ℃時，8個產地降香黃檀葉片中的脯氨酸含量變化幅度不大，從0 ℃降至-3 ℃時，其含量陡增，而后出現(xiàn)下降趨勢。

隨著溫度的下降，8個產地的降香黃檀葉片可溶性糖含量變化均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當溫度降至-3 ℃時，除了產自廣西憑祥的葉片外，其余7個產地的降香黃檀葉片可溶性糖含量均達到最高值。當溫度為20 ℃時，不同產地葉片可溶性糖含量無顯著差異。溫度降至4 ℃以下時，相同處理溫度下不同產地降香黃檀可溶性糖含量存在顯著差異(P<0.05)。

在20 ℃時，8個產地降香黃檀葉片的MDA含量變化不大，但隨著溫度的降低，其含量隨著溫度的降低呈上升趨勢。

表4 低溫處理下不同產地降香黃檀葉片脯氨酸、可溶性糖及丙二醛含量的變化

續(xù)表4 Continued table 4

溫度(℃)Temperature產地Places脯氨酸含量(ng·g-1 FW)Proline content可溶性糖含量(mg·g-1 FW)Soluble sugar content丙二醛含量(nmol·g-1 FW)MDA concent福建福州89.37±3.78a125.89±3.17a21.08±0.98e廣西桂林86.33±8.21a119.39±1.78ab25.15±1.20d廣西憑祥68.55±3.90cd86.53±16.10c34.73±1.12a廣東普寧75.51±3.05bc119.03±13.95ab29.38±2.75bc廣東肇慶76.96±4.19bc105.73±1.21abc31.55±0.24abc-6海南尖峰嶺46.38±4.75bc107.81±4.71a25.94±0.37a海南儋州30.65±2.93d92.63±1.68bc24.67±1.28ab福建仙游41.49±3.70c96.99±5.05bc22.08±0.60bc福建福州54.20±2.34a100.85±5.73ab20.56±1.97c廣西桂林52.54±2.15ab87.98±6.32c22.61±2.42abc廣西憑祥45.40±2.48bc93.69±2.20bc23.04±1.17abc廣東普寧46.12±3.70bc90.34±4.17bc25.30±1.48ab廣東肇慶50.29±2.62ab88.41±0.72c23.66±0.58abc-9海南尖峰嶺40.87±1.45bc83.59±6.44a28.61±0.78ab海南儋州26.52±2.82e77.90±5.31ab26.46±1.18b福建仙游43.77±0.14ab78.00±8.18ab23.18±1.62c福建福州47.78±3.59a89.33±4.12a20.36±1.47c廣西桂林45.56±2.69ab85.62±4.60a22.70±1.18c廣西憑祥31.84±2.47d60.58±3.17b29.89±0.96a廣東普寧36.43±3.12c85.31±13.33a27.40±1.65ab廣東肇慶40.29±3.05bc68.56±15.56ab26.27±1.63b

注：同一溫度下的同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

Note: The same column of data at the same temperature followed by different lowercase letters indicate a significant difference at 0.05 level.

3 討 論

降香黃檀原產于海南，主要分布于中國兩廣地區(qū)及福建等地。降香黃檀有較強的適應性和速生性，但低溫是限制其正常生長的主要非生物脅迫因子之一[13, 21]。降香黃檀在國內不同地域種植時，其抗寒性會因地理環(huán)境產生差異。武彥霞等[22]通過對核桃葉片抗寒性進行研究，發(fā)現(xiàn)植物在受到低溫脅迫時，植物細胞膜的通透性會增大，細胞膜損傷嚴重，相對電導率增加。令凡等[23]對油橄欖的研究結果表明植物在受到低溫脅迫時體內的脯氨酸、可溶性糖和MDA含量均發(fā)生變化。

本試驗中，隨著溫度的降低，8個產地的降香黃檀葉片相對電導率都呈現(xiàn)了上升趨勢，可能是由于在降溫初期，降香黃檀在一定范圍內對低溫脅迫產生了自我保護反應，細胞膜變化不明顯；持續(xù)降溫后，膜的通透性變化幅度增大，此時細胞膜正在遭受嚴重破壞，細胞膜將要基本喪失其功能，電解質因此發(fā)生大量滲透。LT50是植物達到該溫度后呈半致死狀態(tài)，當溫度繼續(xù)降低時，植物所受傷害不可逆轉，甚至死亡，是植物抗寒性重要指標[24]。本試驗中，產地為福建福州的降香黃檀抗寒性最強，其次為廣西桂林，可能是由于兩地緯度較高，年均溫低；海南儋州所產的降香黃檀抗寒性最差，可能是由于該地緯度較低，平均溫度較高。

脯氨酸是植物中必備的滲透調節(jié)劑，降香黃檀在遇低溫脅迫時脯氨酸含量顯著增加，起著保護植物免受滲透脅迫傷害的作用[25-26]。本試驗中，8個產地的降香黃檀經(jīng)過低溫脅迫后，葉片中脯氨酸含量總體呈先上升后下降的趨勢，與羅丹等[27]報道的低溫脅迫對番茄幼苗脯氨酸積累變化趨勢相同，可能原因是植物在降溫初期體內積累大量脯氨酸來提高自身的抗寒性，從而保持細胞膜的活性；后經(jīng)過不斷降溫，植物體內的脯氨酸失活，在植物體內的含量逐漸減少。總體而言，在相同低溫脅迫下，產地緯度高、LT50低的降香黃檀脯氨酸累積能力高于產地緯度低、LT50高的降香黃檀，前者能更好減輕低溫脅迫對自身造成的損傷。

可溶性糖同為降香黃檀葉片中滲透調節(jié)劑，對植物起著保護作用。本試驗中，8個的產地降香黃檀經(jīng)低溫脅迫后，葉片中可溶性糖均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可溶性糖含量最高的葉片產自福建福州，在-3 ℃時含量高達125.89 mg/g，說明產自福建福州的降香黃檀抗寒性最佳，與何云等[28]對3種植物葉片中可溶性糖含量變化趨勢的研究結果一致，表明溫度降低可以提高植物體內的可溶性糖含量，調節(jié)植物組織的滲透壓，提高植物的抗逆性，保護細胞膜的完整性。后期可溶性糖降低可能是過度降溫后植物細胞膜遭到破壞而產生不可逆的影響、細胞膜的通透性變大所導致。

MDA的含量是細胞膜質過氧化反應的重要體現(xiàn)，植物體內中MDA的含量決定著植物細胞膜受到的傷害的嚴重程度。當植物體內MDA含量大量增加時，說明植物細胞膜受到嚴重的破壞。本試驗中，不同產地降香黃檀葉片中MDA含量總體呈上升趨勢，與李吉濤等[29]對不同低溫處理下金花茶MDA含量變化趨勢研究結果相符，表明隨著溫度的降低，植物中MDA含量變高，植物細胞膜質已遭受到了破壞。

然而，不同產地降香黃檀的抗逆境能力評價指標不能僅僅采用上述指標進行定論，還應進一步結合當?shù)氐牡乩韰^(qū)位及氣候條件(如海拔、坡向、光照、水分、土壤、水源條件)等影響因素，同時還要結合植物自身的生長狀況來進行深入的綜合分析評定。

4 結 論

產地為福建福州的降香黃檀抗寒性最佳，廣西桂林、福建仙游、海南尖峰嶺、廣東普寧、廣東肇慶及廣西憑祥所產降香黃檀抗寒性依次減弱，海南儋州所產降香黃檀抗寒性最弱。