基于高通量測(cè)序的苧麻根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)

湯滌洛，涂修亮，付 聰，熊 偉，汪紅武*

(1.咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北省苧麻工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100)

【研究意義】苧麻是中國(guó)極具特色的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量和面積均占全世界的90 %以上[1]。土壤微生物在作物根際分布密集并且聯(lián)系十分緊密[2]，對(duì)根際養(yǎng)分有重要影響[3-5]，研究表明光合產(chǎn)物碳作為樞紐由根系進(jìn)入土壤使根際微域形成巨大的根際碳沉降[6-7]，從而驅(qū)動(dòng)了根際微生物群落變化調(diào)節(jié)植物與微生物的互作關(guān)系[8]，表現(xiàn)為土壤養(yǎng)分的利用效率受土壤微生物活性降低的影響，土壤微生物種群結(jié)構(gòu)不合理將使有害微生物數(shù)量逐漸增多并占優(yōu)勢(shì)[9-12]。【前人研究進(jìn)展】微生物平板培養(yǎng)法、生物標(biāo)記法等傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法往往會(huì)過(guò)低估計(jì)并且無(wú)法詳細(xì)描述土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成[13]。第二代測(cè)序Illumina MiSeq方法避免了通量低、操作復(fù)雜和準(zhǔn)確率低等問(wèn)題[13-14]具有操作簡(jiǎn)單、成本較低、測(cè)序速度更快、通量更高和可信度更高的優(yōu)勢(shì)，并且它集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)進(jìn)行多樣品多可變區(qū)測(cè)序，所以它更適合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定[15, 18-19]。當(dāng)前，苧麻根際微生物群落的研究主要在于微生物數(shù)量與纖維產(chǎn)量關(guān)系、根際微生物量碳氮的差異比較[20-21]，但不同苧麻品種根際土壤微生物多樣性研究較少。【本研究切入點(diǎn)】本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序法研究不同根型苧麻根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，探究不同根型苧麻根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性的差異。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)深入研究苧麻根際群落結(jié)構(gòu)是否合理、根系與土壤微生物互作關(guān)系具有一定的理論意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究地點(diǎn)位于咸寧市崇陽(yáng)縣白霓鎮(zhèn)石山村(114°09′39″E，29°33′04″N)，供試材料分別為湘苧三號(hào)，華苧四號(hào)，黃殼麻，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了湘苧三號(hào)(深根型)、黃殼麻(淺根型)、華苧四號(hào)(中根型)、自然休閑處理(對(duì)照)4個(gè)處理，隨機(jī)排列，3 次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，種苗全部采用統(tǒng)一繁殖的嫩梢扦插苗。

1.2 樣品采集

采樣時(shí)間為2016年9月，按照“S”形在每個(gè)小區(qū)選取采樣點(diǎn)，每個(gè)小區(qū)取6個(gè)點(diǎn)混勻?yàn)?個(gè)樣，3次重復(fù)，共12個(gè)樣品。根際土壤取樣采用“抖根法”，將土壤表面5 cm以上的土壤扒掉，將植株根系從土壤中挖出并抖掉與根系松散結(jié)合的土體，然后將與根系緊密結(jié)合土壤(0～4 mm)用刷子刷下來(lái)作為根際土樣。根際土樣用冰盒帶回存于-80 ℃，用于土壤微生物DNA提取及后續(xù)測(cè)定。

1.3 土壤DNA提取及MiSeq測(cè)序

取0.25 g左右的新鮮土壤樣品，采用試劑盒(PowerSoil DNA Isolation kit，MOBIO Laboratories，Inc.美國(guó))提取各樣本土壤總DNA，用1 % 瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)Gold View染色檢查提取的DNA質(zhì)量。采用ABIGeneAmp 9700型PCR儀，選用可擴(kuò)增的真菌ITS區(qū)段，引物為：1743F-5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和2043R-5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′，指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。PCR反應(yīng)采用20 μl體系，其中含5×FastPfu Buffer 4 μl，dNTPs(2.5 mmol) 2 μl，F(xiàn)orward Primer(5 μmol) 0.8 μl，Reverse Primer(5 μmol) 0.8 μl，F(xiàn)ast PfuPoglymerase 0.4 μl，Template DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μl。PCR擴(kuò)增條件為1×(3 min 95 ℃)；27×(30 s 95 ℃；30 s 55 ℃；45 s 72 ℃)；10 min 72 ℃，10 ℃保存。每個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫后進(jìn)行定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，然后干冰保存快遞至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司用于MiSeq測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

(1)MiSeq高通量測(cè)序所得到的Raw Data, 利用Trimmomatic[22]軟件對(duì)其雙端序列進(jìn)行去雜，再使用FLASH(v1.2.11)[23]軟件進(jìn)行拼接。拼接后的原始序列通過(guò)QIIME (version 8.0)[24]軟件進(jìn)行質(zhì)控后得到clean reads(tags)， cleans reads采用 usearch[25]去除嵌合體序列總共得到優(yōu)質(zhì)序列(reads)

(2)OUT分類(lèi)與統(tǒng)計(jì)。使用 Uparse 軟件對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按序列相似度 97 %進(jìn)行聚類(lèi)，并選取每個(gè) OTU 中豐度最高的序列作為該 OTU 的代表序列[26]。對(duì)OTU 的代表序列同Unite數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比[27]。為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，精簡(jiǎn)去掉豐度值小于總序列條數(shù) 0.001 %的OUT[28]，后續(xù)分析均使用精簡(jiǎn)后的 OTU 列表。

(3)數(shù)據(jù)處理。利用R軟件(VennDiagram) 生成組間 OTU 維恩圖，利用 mothur 軟件中的 summary.single 命令，計(jì)算 Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和 Shannon 指數(shù)等3種常用的α多樣性指數(shù)[29-31]。利用 SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理間根際土壤真菌群落豐富度和多樣性估計(jì)

如表1所示，對(duì)4個(gè)不同處理土壤共得到51 702條優(yōu)質(zhì)序列，樣本優(yōu)質(zhì)序列R1(深根型)、 R2(淺根型)、 R3(中根型)和CK分別讀取了13 546、13 136、15 040、15 751。對(duì)于整個(gè)過(guò)程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如表1所示。不同處理土壤包含共有的真菌群落OTUs，對(duì)照自然休閑處理CK(1135)的OUT數(shù)量高于處理深根型處理R1(641)，淺根型處理R2(778)，中根型處理R3(1106)，種植苧麻的根際土壤的OUT數(shù)量為R3(中根型)> R2(淺根型)> R1(深根型)真菌群落多樣性的非參數(shù)估計(jì)，群落豐富度指數(shù)Chao1數(shù)、群落多樣性指數(shù)Shannon和Simpson 表現(xiàn)為R3(中根型)> R2(淺根型)> R1(深根型)，但是都低于對(duì)照處理CK。

總體來(lái)看，不同根型土壤根際真菌群落的OUT 數(shù)量、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)存在差異并表現(xiàn)一定的規(guī)律性，即R3(中根型)> R2(淺根型)> R1(深根型)>CK，表明：①自然休閑處理的真菌多樣性較種植苧麻的根際土壤豐富，這說(shuō)明苧麻根系對(duì)根際定殖土壤真菌有一定的選擇性；②種植不同根型苧麻的根際土壤真菌群落多樣性存在差異，并表現(xiàn)為種植中根型苧麻的根際土壤真菌群落要比種植淺根型、深根型苧麻豐富。

表1 不同處理真菌群落豐富度及多樣性指數(shù)

2.2 不同處理土壤根際真菌群落比較

從圖1可以看出，4個(gè)不同處理的土壤真菌分為兩類(lèi)，CK為一類(lèi)，處理R1(深根型)和R3(中根型)組成相似性高，并與R2(淺根型)聚為一類(lèi)，說(shuō)明這3個(gè)處理的趨同性較高。

從圖2可以看出，如，R1(深根型)和 R2(淺根型) 共同含有197個(gè) OUT； R2(淺根型) 和 R3(中根型)共同含有247個(gè)OTU，R1(深根型)和R3(中根型) 共同含有235個(gè) OUT；CK與R1(深根型)、

圖1 不同處理相似性聚類(lèi)圖Fig.1 Similarity clustering of different treatments

圖2 不同處理土壤真菌群落 OTUs 韋恩圖Fig.2 Venn diagram of OTUs of soil fungal communities in different treatments

R2(淺根型)、R3(中根型)共同含有的OUT分別為：160、149、181。

聚類(lèi)分析與韋恩圖結(jié)果均表明，種植不同根型苧麻的根際土壤真菌組成相似，但是種植苧麻的土壤真菌組成與對(duì)照自然休閑處理的土壤根際存在差異。

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，4個(gè)不同處理土壤中真菌群落主要有子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)及未分類(lèi)的真菌(Fungiun-classified)，種植苧麻的根際土壤中擔(dān)子菌門(mén)為第一優(yōu)勢(shì)門(mén)，都達(dá)到50 %左右，其次為子囊菌門(mén)。而對(duì)照自然休閑處理子囊菌門(mén)(47.51 %)為第一優(yōu)勢(shì)門(mén)，其次為擔(dān)子菌門(mén)(25.00 %)。

如圖4所示，傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱 (Eurotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、圓盤(pán)菌綱(Orbiliomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)、壺菌綱(Chytridiomycetes)、等組成土壤真菌群落的真菌綱，傘菌綱為所有處理中的第一優(yōu)勢(shì)菌綱，所占比例表現(xiàn)為R1(深根型)>R2(淺根型) >R3(中根型)>CK，分別為72.60 %、69.81 %、46.99 %、22.92 %。但是第二優(yōu)勢(shì)菌綱散囊菌綱所占比例表現(xiàn)為R2(淺根型)

圖3 同處理門(mén)水平真菌群落組成Fig.3 Fungal communities in different treatment at phylum level

圖4 不同處理綱水平真菌群落組成Fig.4 Fungal communities at class level in different treatments

如圖5所示，屬水平豐度較高的有木耳屬(Auricularia)、梨孢霉屬(Coniosporium)、斜蓋傘屬(Clitopilus)，R1(深根型)、 R2(淺根型)處理的優(yōu)勢(shì)菌屬為木耳屬(Auricularia)，其中在R2(淺根型)所占的比例最高為35.12 %，R1(深根型)為7.91 %； R3(中根型)、CK處理的優(yōu)勢(shì)菌屬梨孢霉屬(Coniosporium)，其中CK所占的比例最高為7.80 %，R3(中根型)比例為2.05 %。

3 討 論

3.1 種植不同根型苧麻對(duì)根際土壤真菌多樣性的影響

多樣性指數(shù)越高表明微生物群落多樣性越豐富。本研究結(jié)果表明，種植苧麻的根際土壤的OUT數(shù)量、群落豐富度指數(shù)Chao1數(shù)、群落多樣性指數(shù)Shannon和Simpson 都表現(xiàn)為R3(中根型)> R2(淺根型)> R1(深根型)>CK。這說(shuō)明，①不同根型苧麻的根際土壤真菌群落豐度具有一定差異并表現(xiàn)出一定的規(guī)律。②沒(méi)有種植苧麻的根際土壤真菌多樣性較種植苧麻豐富。③種植苧麻的土壤中根型苧麻的根際土壤真菌多樣性最為豐富。本研究支持了植物根系對(duì)根際定殖的土壤真菌具有一定的選擇性這一結(jié)論[32-33]， 并可以推測(cè)出不同根型苧麻對(duì)根際定殖的真菌類(lèi)群仍存在選擇性。

3.2 種植不同根型苧麻對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響

土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要的作用。苧麻的根際土壤真菌包括擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)及未分類(lèi)的真菌(Fungiun-classified)，擔(dān)子菌門(mén)為第一優(yōu)勢(shì)門(mén)。這些門(mén)也分布在其他作物種植的根際土壤中[34]。傘菌綱為第一優(yōu)勢(shì)菌綱，屬水平豐度較高的有木耳屬(Auricularia)、梨孢霉屬(Coniosporium)、斜蓋傘屬(Clitopilus)。這一方面說(shuō)明苧麻對(duì)根際定殖的土壤真菌具有選擇性，另一方面這些真菌在苧麻根際能大量定殖可能與該類(lèi)真菌的生態(tài)功能有關(guān)。這支持了根系對(duì)土壤真菌的選擇影響了植物與微生物的互作關(guān)系這一結(jié)論[35]。

圖5 不同處理屬水平真菌群落組成Fig.5 Fungal communities at genus level in different treatments