植物性神經對圍著床期大鼠子宮中肥大細胞和組織胺含量的影響

黃麗波，張秀霞，范曉杰，侯衍猛，姜淑貞，魯 璇, 袁學軍

(1. 山東農業大學動物科技學院，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東省畜禽疫病防制工程技術研究中心，泰安 271018； 2. 山東省農業科學院，濟南250014； 3. 山東農業大學生命科學學院，泰安 271018)

肥大細胞(mast cell，MC)是一種包含異嗜顆粒的多功能免疫活性細胞和免疫調節細胞[1]，能分泌和釋放幾十種介質和細胞因子,包括組織胺、蛋白酶、炎性因子等[2]，在多種生理和病理過程中發揮重要作用。肥大細胞在體內廣泛分布，子宮中肥大細胞在發情周期、著床、妊娠和分娩過程中具有重要作用[3]，子宮中肥大細胞數量和組織胺水平與發情周期中子宮內免疫水平密切相關[4]，肥大細胞比T細胞更能代表子宮免疫水平[5]。

胚胎著床是由神經、內分泌和免疫系統共同參與的復雜的生理過程，包括胚泡定位、附著和滋養層浸潤[6]。胚胎著床中滋養層浸潤是一個可控的炎癥反應，在著床前需要在子宮內膜局部炎性擴張，在附著浸潤后又要降低免疫水平避免免疫排斥。在圍著床期大鼠子宮內組織胺濃度升高，增加了子宮血管的通透性，為著床做好準備[7]。組織胺是胚胎著床所需的炎性介質。來源于胚胎的組織胺釋放因子可誘導子宮肥大細胞釋放組織胺，作用到囊胚的組織胺受體上而啟動著床[7]，防止母體的免疫排斥[8]。組織胺通過H1受體抑制滋養層細胞凋亡[9-10]，進而影響滋養層細胞分化[11]和浸潤。子宮內組織胺可來源于肥大細胞[12]和子宮上皮細胞[13]；子宮上皮細胞內組織胺通過組氨酸脫羧酶轉化生成[13]。肥大細胞可以存儲已合成的組織胺，當細胞活化后釋放。

孕前切除支配子宮的植物性神經導致的大鼠胚胎著床抑制或延遲，并且與孕5 d子宮中肥大細胞數目增加及組織胺的釋放密切相關[14]。但是在著床前、后肥大細胞和組織胺的動態變化規律還不清楚。本研究通過切除植物性神經，觀察神經對胚胎著床影響、檢測著床前后子宮中肥大細胞數量和組織胺的含量變化，從而揭示植物性神經對著床和子宮局部細胞免疫的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇健康的性成熟Wistar雌性大鼠為試驗動物(購自山東大學實驗動物中心)，180日齡，采取自繁自養的模式建立試驗所需的雌鼠90只，體重為300～350 g，自由采食、飲水，在恒溫條件下進行飼養。

1.2 試驗設計

將90只雌性性成熟大鼠隨機分為對照、假手術和手術處理(n=30)3組，組間初始體重差異不顯著(P>0.05)。假手術處理組大鼠在腹壁切下一塊脂肪；手術組大鼠先進行手術切除支配子宮的植物性神經(腸系膜后神經節節后纖維和盆神經叢節前纖維)，20 d后，傷口愈合，開始試驗。各組內再分為妊娠4、5、6 d 3組(n=10)。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 樣本采集 待大鼠妊娠4、5、6 d，將其麻醉致死，剖腹迅速取出卵巢、子宮，稱重，觀察排卵、著床情況，并采集子宮樣品，加入臺氏液，用于肥大細胞計數和組織胺含量分析。

1.3.2 肥大細胞計數和組織胺含量分析 子宮稱重，置臺氏液中剪碎，用胰酶(濃度：1 mg·mL-1，加10 mg·g-1子宮重的胰酶)消化，放入CO2培養箱(37 ℃， 5%的CO2)消化1 h，150目細胞篩過濾，2 700 r·min-1離心5 min，棄上清，加入含BSA的臺氏液3～5 mL，2 700 r·min-1離心5 min，棄上清，留沉淀加入2 mL臺氏液，混勻后進行甲苯胺藍染色，肥大細胞計數。用臺氏液稀釋細胞液按(5～10)×105·mL-1分裝，一部分3 068 r·min-1離心8 min，取上清，用于測肥大細胞自發釋放組織胺的量。另一部分煮沸10 min，再離心，取上清，測子宮組織胺總含量。組織胺含量檢測按照rat histamine ELISA檢測試劑盒(CSB:E07862r，購自CASABIO

公司)說明書進行操作。

1.4 數據分析

用SPSS軟件進行統計學分析相關數據，試驗結果用“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 大鼠子宮著床點和卵巢排卵點數量

切除植物性神經后，大鼠子宮內著床點明顯減少，而卵巢排卵點無明顯變化。卵巢的排卵點數量統計結果(表1)顯示，雙側排卵點基本維持在14～16個，切除植物性神經后無顯著變化(P>0.05)，表明植物性神經對卵巢排卵無顯著影響。

對照組大鼠在妊娠4 d時基本觀察不到著床點，因為大鼠胚胎著床開啟是在妊娠第5天，可以看到略微突起的著床點。對照組和假手術組子宮的著床點同一時期差異不顯著(P>0.05)。切除植物性神經對大鼠著床點的影響較為強烈，手術組在妊娠5、 6 d著床點很少或觀察不到，僅個別鼠有少數胚胎著床，與對照組和假手術組比均差異極顯著(P<0.01)(表1)。

表1切除植物性神經后大鼠子宮著床點和卵巢排卵點數

Table1Consequenceofuterineautonomicnerveamputationonthenumberofimplantationsitesandovulatedsites

組別Group著床點 No.of implantation排卵點No.of ovulationd4d5d6d4d5d6對照組Control0.00±0.0012.00±1.7312.0±1.8314.00±2.0014.50±0.5815.25±1.71手術組Operation0.00±0.000.80±1.40??0.67±1.15??15.67±1.5314.00±1.7314.00±1.83假手術組Sham operation0.00±0.0011.00±2.0013.00±1.7313.75±1.7114.75±1.7115.00±1.41

表內同一列數據進行差異顯著性比較，*.P<0.05；**.P<0.01

Difference significance is compared in the same column in the table,*.P<0.05；**.P<0.01

2.2 大鼠子宮組織胺含量的檢測

ELISA檢測子宮組織中組織胺含量，結果表明：對照組大鼠子宮自發釋放組織胺含量表現為在妊娠4、6 d高，5 d最少的波動變化(表2)。子宮可釋放的組織胺總量在妊娠4 d最高，到妊娠5 d明顯降低(P<0.05)，妊娠6 d略有升高(表2)。這說明在著床前子宮自發釋放組織胺量和可釋放總量處于較高水平，為胚胎著床提供微環境。假手術組變化趨勢同對照組基本一致。

切除支配子宮的植物性神經后，雖然子宮自發釋放組織胺量在妊娠4～6 d表現出與正常對照一致的波動變化(表2)，但同期數值明顯下降，尤其是在妊娠4、6 d差異顯著，在妊娠4 d由(13.75±0.67) pg·g-1子宮重降至(8.12±1.51)pg·g-1子宮重，在妊娠6 d由(16.56±1.19) pg·g-1-子宮重降至(8.84±0.83) pg·g-1子宮重(P<0.05)。子宮可釋放組織胺的總量在妊娠4 d極顯著降低(P<0.01)，由對照組的(43.04±2.99) pg·g-1子宮重降至(20.32±3.17) pg·g-1子宮重(P<0.001)；在妊娠5、6 d數值與對照相近(表2)。這說明植物性神經可影響著床前子宮內釋放組織胺。

2.3 圍著床期大鼠MC數量統計

子宮組織經酶消化細胞染色后獲得肥大細胞數量統計結果見表3。結果表明，對照組妊娠4、6 d大鼠子宮肥大細胞數量較高，在妊娠5 d數量最少，為6.57×106·g-1子宮重，與妊娠4、6 d相比差異顯著(P<0.05)。切除支配子宮的植物性神經后，手術組的肥大細胞數量在妊娠4～6 d表現為不同于對照組，在妊娠4 d顯著低于對照組(P<0.05)，妊娠5 d肥大細胞數量顯著高于對照組同期水平(P<0.05)， 到妊娠6 d還低于對照組同期數量(表3)。切除神經后，手術組的子宮肥大細胞數在妊娠4～6 d的變化與子宮組織胺總含量變化呈現相同的變化趨勢(表2、3)。5～6 d假手術組結果同對照組基本一致，差異不顯著(表3)。

表2圍著床期子宮組織胺含量變化

Table2Thechangesinhistaminecontentinuterusduringperi-implantation

pg·g-1

組間數據差異顯著性比較用*表示，*.P<0.05；**.P<0.01；組內數據差異顯著性比較用不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Difference significance in data between groups is expressed in signal “*”, *.P<0.05；**.P<0.01; Difference significance of data in group is expressed in different superscript letters(P<0.05).The same as below

表3圍著床期大鼠子宮肥大細胞的數量

Table3Thenumberofmastcellinratuterusduringperi-implantation

(×106·g-1)

3 討 論

3.1 植物性神經影響胚胎著床與子宮中肥大細胞的關系

本試驗結果發現，在妊娠4～6 d，子宮中肥大細胞數量呈現明顯波動，而且切除植物性神經后，數量發生明顯變化，同時胚胎著床出現延遲和減少，提示，在著床窗口期，肥大細胞數量的顯著改變可能與胚胎著床關系密切，且與支配子宮的植物性神經有關。這一結果與筆者前期工作結果[14]是一致的。本試驗結果顯示，子宮中肥大細胞在妊娠4 d有一個高峰。肥大細胞作為免疫功能和免疫調節細胞[15-16]，可釋放炎性介質，引起局部黏膜血管擴張，有利于炎性細胞的募集，肥大細胞還可以釋放趨化因子[17]、TNF-α[18]、IL[19]等炎性介質募集血液中白細胞、免疫細胞到子宮內膜，維持子宮內膜局部著床所需的免疫環境。到妊娠5 d子宮肥大細胞數量明顯降下來，可以避免過度的免疫刺激，與其他免疫細胞一起參與胎母界面免疫耐受[20]。而切除植物性神經后，肥大細胞在妊娠4 d明顯低于正常，不足以刺激局部炎癥反應，不利于胚囊附著和浸潤，而妊娠5 d時，肥大細胞數量又明顯高于正常，可能會引起免疫排斥，導致著床延遲或不能著床。

關于肥大細胞在胚胎著床中的作用，文獻報道中存有爭議，Salamonsen等[21]、Menzies等[22]報道認為肥大細胞在鼠類胚胎著床中不起作用。Salamonsen等[21]發現，在妊娠7 d大鼠子宮內著床點與非著床點之間肥大細胞數量沒有變化，而且肥大細胞主要分布在子宮肌層；而小鼠研究結果證實，在孕1～8 d 小鼠子宮內著床點附近蛻膜內沒有肥大細胞，因而認為肥大細胞對著床不起作用[13]。但是檢測肥大細胞時間已過了大、小鼠胚胎著床窗口期(4～5 d)， 其結論有待進一步驗證。Menzies等[22]發現,用肥大細胞缺陷小鼠(C57BL/6J-KitW-sh/W-sh，表現為c-Kit限制性基因表達)同源交配后產生的后代，與野生型后代在初生重和胎母界面指數無明顯差別，由此也認為肥大細胞對著床影響不大。但同源雜交本身就有遺傳穩定性的問題，Woidacki等[23]用同樣的基因鼠(C57BL/6J-KitW-sh/W-sh)發現通過異源交配后胚囊著床明顯減少，而移植野生型的小鼠肥大細胞后可正常著床。Treg誘導出現小鼠胎母界面免疫耐受后肥大細胞相關基因(Thp1、Mcpt1和Mcpt5)表達出現上調，提示肥大細胞可能參與胎母界面免疫耐受[20]。而且肥大細胞對著床期間組織重構，以及后來胎盤和胎兒生長都有重要作用[24]。

3.2 植物性神經影響胚胎著床與組織胺釋放的關系

切除支配子宮的植物性神經可以延遲或減少胚胎著床，并且明顯改變了大鼠妊娠4～6 d子宮內組織胺水平，推測植物性神經影響胚胎著床可能是通過組織胺釋放改變了子宮免疫水平和胚胎著床所需的微環境來實現的[14]。因為正常情況下，妊娠4 d組織胺水平有一高峰，組織胺可使子宮內膜局部腫脹，利于胚泡浸潤和侵入，維持著床所需微環境，這一結果與Paria等[13]相關報道是一致的。而切除植物性神經后，組織胺水平在妊娠4 d明顯低于正常，不足以刺激局部炎癥反應，不利于胚囊附著和浸潤，導致著床延遲或不能。

關于肥大細胞與組織胺的關系，組織胺是肥大細胞的一種主要組成的活性介質[25],有報道證實小鼠子宮肥大細胞數量與組織胺濃度變化是平行的[26]，本試驗結果顯示，正常妊娠大鼠4～6 d子宮中自發釋放組織胺含量與肥大細胞數量的變化趨勢基本一致，這表明在妊娠4～6 d，子宮局部胚胎著床微環境中組織胺水平與肥大細胞活化密切相關。肥大細胞組織學方面的證據也支持這一推論，在系膜三角區有大量肥大細胞可直接釋放組織胺經血液循環到達子宮內膜，因為子宮的所有血管和神經支配都經過系膜進入子宮內部[27]。切除植物性神經后,妊娠4～6 d大鼠子宮中組織胺可釋放量與肥大細胞數量的變化趨勢基本一致，尤其在妊娠4 d，子宮組織胺總濃度與肥大細胞數量一樣都顯著低于正常水平。這一結果說明植物性神經可以調節子宮內組織胺的釋放，在妊娠4 d大鼠子宮中肥大細胞是神經影響組織胺釋放的主要來源，或者說神經可通過肥大細胞影響組織胺釋放的。這和筆者前期的體外試驗證明大鼠子宮肥大細胞組織胺的釋放能夠被神經肽SP調節的報道[14]是相吻合的。在皮膚和腸道組織已發現神經-肥大細胞形態功能聯系，植物性神經可調節肥大細胞功能[28-29]。但是在子宮內還未見有類似的資料報道。已有的研究資料表明子宮中肥大細胞組織胺的釋放受生殖激素影響[26,30]，那么本試驗結果中神經對組織胺釋放的影響是通過神經的直接作用，還是間接作用還有待于進一步研究驗證。

4 結 論

本研究結果表明，大鼠子宮中肥大細胞和組織胺含量在妊娠4～6 d呈現波動變化，這種變化對維持胚胎著床所需的免疫環境有重要作用。支配子宮的植物性神經可調節著床期子宮中肥大細胞數量和組織胺釋放，改變子宮局部免疫水平和微環境，參與胚胎著床調控。

致謝：感謝山東省自然科學基金資助項目(ZR2010CM052)，山東省教育廳高等學?？萍加媱澷Y助項目(J11LC26)和山東省“雙一流”獎補資金對本研究的經費支持。