TRPV6基因沉默對蛋雞十二指腸和空腸鈣離子跨細胞轉運相關蛋白表達的影響

孟范勇，鄧益鋒，楊俊花，崔 軍，周振雷，侯加法*

(1. 南京農業大學動物醫學院，南京 210095；2.上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403)

蛋雞在產蛋高峰每天需補充大量的鈣質以滿足蛋殼鈣化的需要，每個雞蛋含鈣2～3 g，年產300枚以上的現代商品蛋雞，鈣的消耗是其體內鈣總量的30倍[1-2]。腸道作為蛋殼鈣源的主要來源必須保持高效的運轉以滿足這種連續高產的要求，一旦發生腸道鈣離子轉運障礙，極易引起蛋雞產蛋率下降，誘發骨質疏松等疾病。多年來，科研人員一直致力于蛋雞腸道內鈣離子高效轉運的機制探索。研究發現，腸道上皮細胞鈣離子轉運包括兩種有效途徑：不飽和旁細胞轉運和飽和跨細胞轉運，其中以瞬時性受體電位通道香草酸受體6(transient receptor potential vanilloid receptor 6, TRPV6)為限速步驟的跨細胞轉運途徑在動物腸道鈣離子轉運過程起重要作用。主要包括以下三個步驟：首先通過TRPV6跨膜通道把鈣離子轉運至細胞內；然后進入細胞內的鈣離子與calbindin-D28K(CaBP-D28K為禽類主要形式)和(或)calbindin-D9K(CaBP-D9K)結合并擴散至基底膜；最后，通過膜上的鈉-鈣交換蛋白1(NCX1)、ATP依賴的細胞膜鈣離子ATP泵(PMCA 1b)把鈣離子轉運到細胞外[3]。研究表明，這些蛋白主要承擔維持機體鈣離子平衡，保障鈣離子參與的生理活動：骨形成、肌肉收縮、程序化細胞凋亡、細胞增殖過程、離子代謝、凝血等[4]。TRPV6是瞬時性受體電位通道(transient receptor potential，TRP)超家族中的成員，是專門的上皮樣鈣離子“門控”通道，在兔、鼠和人的胰腺、十二指腸、空腸、結腸、骨組織等與鈣離子跨細胞轉運功能有關的器官都有表達[5-8]。在敲除小鼠的TRPV6基因后，腸道呈現嚴重的鈣離子吸收異常，以及腎重吸收障礙[6]，表明TRPV6在調控腸道鈣離子轉運方面具有重要意義。實驗室的前期研究發現，TRPV6在蛋雞腸道上皮細胞也存在高表達，并且十二指腸表達量顯著高于其他腸段[9]。其他研究顯示，在禽類組織，鈣的吸收幾乎局限在十二指腸和空腸，回腸和結腸幾乎沒有吸收[10]，故推測TRPV6在蛋雞腸道鈣離子轉運過程發揮重要作用。目前，關于產蛋高峰期TRPV6在腸道鈣離子轉運中的作用還未曾報道。因此，本項目擬采用RNA干擾(RNAi)技術，體外構建TRPV6的RNAi干擾質粒，注入產蛋雞體內，采用基因沉默手段研究TRPV6對小腸內鈣離子跨細胞轉運調節作用，旨在闡明TRPV6在蛋雞腸道內調控鈣離子轉運的作用機制，為蛋雞腸道鈣離子轉運障礙及骨代謝異常致病機制及防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組pSIREN-TRPV6-3質粒(由本實驗室保存)。E.coliCompetent Cells DH5α、限制性內切酶MluⅠ、Trans 2KTMPlusⅡDNA Marker、Mini BEST Plasmid Purification Kit質粒小提試劑盒、SYBR Prime Script PR-PCR Kit、SYBR Premix ExTaqKit均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa，日本)。無內毒素質粒大提取試劑盒購自美國OMEGA。TRPV6兔抗人多克隆抗體購自以色列Alamone Labs(ACC-036)，CaBP-D28K鼠單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，GAPDH鼠克隆抗體購自上海康城生物技術有限公司(KC-5G4)。雞源甲狀旁腺素(PTH)ELISA測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

臺式離心機(Eppendorf，德國)，-80 ℃超低溫冰箱，高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)，數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司，中國)，核酸蛋白檢測儀(Eppendorf，德國)，凝膠成像系統(TanonGIS-2500，上海)，DNA電泳儀(Bio-Rad，美國)，實時熒光定量PCR儀ABI 7300(ABI，美國)等。

1.2 方法

1.2.1 質粒的提取、酶切鑒定與測序 攜帶質粒pSIREN-TRPV6-3的大腸桿菌由本實驗室保存。選取陽性克隆菌，在含有氨芐青霉素(AMP)100 μg·mL-1的LB培養基上37 ℃培養18 h。使用TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification Kit(按照說明書操作)提取質粒DNA，然后用MluⅠ酶切。將酶切產物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。提取到的重組質粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen-TRPV6-siRNA寄往上海英駿生物技術公司進行序列測定以鑒定TRPV6-shRNA是否插入正確，pSIREN序列引物為5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′。

1.2.2 重組質粒注射液準備 根據N/P比值計算公式[11]：N/P=PEI (μg)/DNA(μg)×7.75進行計算。按照N/P比值為10，將重組質粒與聚乙烯亞胺(PEI)混合，溶于生理鹽水，振蕩混勻，靜置15 min， 在30 min內注射入蛋雞左側大腿肌肉，每只蛋雞注射相應質粒200 μg(0.5 mL)。

1.2.3 動物飼料管理及樣品采集 64羽220日齡精神狀況良好、體重一致的伊莎高產蛋雞，隨機分為對照組和試驗組，每組32只。試驗組一次性肌內注射0.5 mL質粒注射液(生理鹽水稀釋)，對照組注射生理鹽水做空白對照，預試期1周，連續觀察28 d。

同舍飼養于階梯式蛋雞籠，依籠編號，按照集約化蛋雞養殖場常規方法飼養管理，雞舍采用自然光與人工補充光照16∶8(L/D)。試驗雞自由飲水，按照標準日糧飼喂。分別于注射后第7、14、21及28天翅靜脈采血5 mL，1%肝素抗凝，離心，血漿保存于EP管中，-20 ℃保存。然后每組選擇8只雞斷頭處死，采集十二指腸、空腸、股骨及脛骨。去除腸系膜及脂肪組織。縱向將腸管剖開，4 ℃預冷DEPC(焦磷酸二乙酯)配制PBS(pH7.4)緩沖液沖洗腸內容物，吸水紙吸干水分。將樣品迅速裝入凍存管，液氮速凍，后轉入-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 十二指腸和空腸中TRPV6轉染質量鑒定 使用DNA提取試劑盒提取十二指腸和空腸中總DNA。PCR步驟按試劑盒說明進行， PCR產物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產物長度為700 bp。設計重組質粒綠色熒光蛋白ZsGreen引物，F: 5′-AAGGAGATGACCATGAAGTACCG-3′，R: 5′-AAACT-AGAGCCTGGACCACTGA-3′，由上海Invitrogen生物技術有限公司合成。

1.2.5 實時熒光定量PCR 按照RNAiso Plus試劑盒說明提取組織中總RNA，RNA濃度用nanodrop微量分光度計測定。使用TaKaRa反轉錄試劑盒，按說明配制20 μL反轉錄體系，37 ℃反應15 min， 85 ℃滅活5 s，cDNA樣品置-20 ℃保存備用。

采用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒，按說明書冰上配制20 μL擴增體系。目的基因擴增條件見表1。熔解曲線條件：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。每個樣品重復3次，設空白作為對照。通過TRPV6、CaBP-D28K、NCX1、PMCA1b和β-actin基因在熒光信號到達閾值時所經歷循環數Ct值。用2-△△ Ct法以雞β-actin為內參基因對有效的數據進行統計分析，算出TRPV6、CaBP-D28K、NCX1和PMCA1b基因在十二指腸與空腸的相對表達水平。

1.2.6 引物設計與合成 根據本實驗室已設計的雞TRPV6、CaBP-D28K、NCX1、PMCA1b引物序列及文獻報道的內參基因β-actin引物序列見表1，由上海Invitrogen生物技術有限公司合成引物。

1.2.7 Western blot分析 取組織100 mg于1 mL 裂解液中冰上勻漿，靜置30 min，待裂解完全，離心30 min (4 ℃，25 000 g)。取上清BCA法測定蛋白含量，按上樣緩沖液、樣品體積比1∶4混合，沸水加熱5 min，12 000 g離心5 min，取上清。每個樣品的上樣量為40～80 μg，在100 V、25～50 mA條件下進行SDS-PAGE電泳。對照蛋白Marker，將膠條、硝酸纖維素膜切割至合適大小做好的“三明治”夾子放入轉印槽中，4 ℃、100 V條件下轉印80 min。 后將NC膜置5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。 棄封閉液，TBST洗膜。一抗孵育：加入按比例稀釋的抗體(用5%脫脂奶粉分別將TRPV6、CaBP-D28K、β-actin抗體以1∶200、1∶200、1∶10 000 比例稀釋)，4 ℃過夜。TBST洗膜，重復5次。二抗孵育：加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(TRPV6二抗為羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋；CaBP-D28K和β-actin 二抗為羊抗鼠IgG，1∶10 000稀釋)，室溫孵育2 h。TBST洗膜，將ECL試劑盒內的試劑A與試劑B等體積混合后，均勻滴在硝酸纖維素膜上，5 min 后將硝酸纖維素膜和X線片同時置于暗盒中，壓片，根據熒光強弱決定曝光時間，顯影、定影。掃描儀拍照Western blot結果，用軟件檢測分析灰度值，并計算樣品中目的蛋白的相對表達量。

表1Real-timePCR目的基因引物序列

Table1PrimersequencesofReal-timePCRtargetgenes

目的基因Target genesPCR產物長度/bpLength of PCR productsGenBank登錄號GenBank accession No.引物序列(5′→3′)Primer sequences退火溫度和時間Annealing temperature and timeβ-actin300NM205518F:TGCGTGACATCAAGGAGAAGR:TGCCAGGGTACATTGTGGTATRPV6141XM416530F:TGGAACGGACTAAGTCAGAAGTTGR:CGTTATGGCTGGGATGTTGTTCaBP-D28K297EU404189F:TTAAATCTGCGTTGCTTCCATACAR:GGCCCATCCTGCACTCCATAACNCX1178DQ987923F:TCACCTTCTTCTTCTTCCCAATCTR:GCAACCTTTCCGTCCATCTCPMCA1b98XM416133F:TTCAGGTACTCATGTGATGGAAGGR:CAGCCCCAAGCAAGGTAAAG94 ℃, 15 s, 60～64 ℃, 10 s (40個循環)

1.2.8 血鈣、血磷濃度及PTH水平測定 血液自動生化分析儀測定血鈣、血磷濃度，ELISA試劑盒測定血漿PTH濃度。

1.2.9 骨密度測定 剔凈附著在股骨和脛骨上的軟組織，與16級鋁階一同置于暗盒上拍片。脛骨和股骨采用前后位放置。拍攝條件：焦點焦片距(FFD)80 cm，球管電壓45 kV，2.5 mAs。在測定前，根據圖像情況進行預處理，用NIH Image J圖像軟件處理，建立鋁階的厚度和灰度曲線，根據曲線，將測得的灰度信息轉化成鋁階厚度。骨密度以毫米鋁階厚度(mmAl)表示。

1.3 數據統計與分析

所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。差異顯著性檢驗采用單因子方差分析(one-way ANOVA)，LSD進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，所有結果均以平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 pSIREN-TRPV6-3質粒酶切鑒定與測序

小量提取質粒后進行酶切鑒定，用MluⅠ酶切消化，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見酶切后的質粒只存在單一條帶，與未酶切質粒存在差異，說明shRNA片段連接在載體(圖1)。測序結果顯示，重組質粒pSIREN-TRPV6-3中目的片段序列與設計的shRNA序列一致(圖2)。

1. 酶切的pSIREN-TRPV6-3質粒；2. 未酶切的pSIREN-TRPV6-3質粒；M. Trans2KTM PlusⅡDNA相對分子質量標準
1. Digested pSIREN-TRPV6-3 plasmid；2. Undigested pSIREN-TRPV6-3 plasmid；M. Trans2KTM PlusⅡ DNA marker
圖1 重組質粒酶切鑒定
Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid

2.2 十二指腸與空腸內重組質粒pSIREN-TRPV6-3表達

圖3結果顯示，在第7、14及21天的十二指腸和空腸中均擴增到重組質粒中綠色熒光蛋白ZsGreen的表達，表明肌內注射質粒在十二指腸與空腸中均成功轉染。

2.3 TRPV6基因沉默對十二指腸和空腸鈣離子跨細胞膜轉運相關蛋白mRNA表達的影響

圖4和圖5結果顯示，在注射重組質粒pSIREN-TRPV6-3后，與對照組比較，試驗第7、14及21天十二指腸、空腸中TRPV6和CaBP-D28K mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，其中第14天差異極顯著(P<0.01)，第28天 TRPV6表達有降低趨勢，但統計學差異不顯著(P>0.05)。但是，PMCA1b和NCX1 mRNA的表達無明顯差異(P>0.05)，結果表明TRPV6基因沉默嚴重干擾了腸道中TRPV6和CaBP-D28K的表達。

圖2 重組質粒測序結果
Fig.2 Sequencing results of recombinant plasmid

1～5. 空白對照、第7、14、21、28天；M. DL2000 DNA相對分子質量標準
1-5. The control, the 7th, 14th, 21st and 28th day, respectively; M. DL2000 marker
圖3 重組質粒十二指腸和空腸基因組擴增結果
Fig.3 Results of amplification of genome from duodenum and jejunum after transfection of pSIREN-TRPV6-3

與對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01。下同
Compared with the control group, *.P<0.05，**.P<0.01.The same as below
圖4 pSIREN-TRPV6-3轉染后十二指腸鈣離子轉運相關蛋白mRNA表達變化
Fig.4 The mRNA expression of relative proteins in duodenum calcium transport genes after transfection of pSIREN-TRPV6-3 plasmid

圖5 pSIREN-TRPV6-3轉染后空腸鈣離子轉運相關蛋白mRNA表達變化
Fig.5 The mRNA expression of relative proteins in jejunum calcium transport genes after transfection of pSIREN-TRPV6-3 plasmid

2.4 TRPV6基因沉默對十二指腸和空腸TRPV6和CaBP-D28K蛋白表達的影響

圖6和圖7結果顯示，在注射重組質粒pSIREN-TRPV6-3后，與對照組比較，試驗第7、14及21天十二指腸和空腸中TRPV6和CaBP-D28K的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，其中第14天差異極顯著(P<0.01)，第28天表達有降低趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，結果與mRNA表達水平一致。

圖6 十二指腸與空腸TRPV6蛋白表達
Fig.6 Expression of TRPV6 protein in duodenum and jejunum

2.5 TRPV6基因沉默對血漿鈣、磷濃度的影響

圖8結果顯示，與空白對照組比較，TRPV6基因沉默組在不同時間點血漿中鈣、磷濃度均無顯著差異(P>0.05)。

2.6 TRPV6基因沉默對血漿PTH水平的影響

圖9結果顯示，TRPV6基因沉默組在轉染后第7天血漿PTH水平顯著上升(P<0.05)，在第14、21天 極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.7 TRPV6基因沉默對股骨和脛骨放射密度的影響

圖10結果顯示，與對照組相比，注射重組質粒pSIREN-TRPV6-3后，試驗組蛋雞股骨和脛骨骨密度有降低趨勢，但統計學差異并不顯著(P>0.05)。

3 討 論

新型鈣離子通道TRPV6一直被認為是鈣離子跨細胞轉運的重要通道。本實驗室前期發現TRPV6可以在產蛋雞小腸、腎及蛋殼腺中發現TRPV6的表達，且十二指腸TRPV6的表達最為豐富[9]，提示TRPV6可能是腸鈣吸收的重要通道。

圖7 十二指腸與空腸CaBP-D28K蛋白表達
Fig.7 Expression of CaBP-D28K protein in duodenum and jejunum

圖8 血漿鈣、磷濃度的變化
Fig.8 The changes of calcium and phosphonium concentration in plasma

圖9 血漿PTH濃度變化
Fig.9 The change of PTH level in plasma

圖10 各組股骨和脛骨放射骨密度
Fig.10 Bone radiographic density of the tibia and femur in different groups

3.1 pSIREN-TRPV6-3質粒酶切鑒定及腸道內轉染驗證

RNA干擾技術是通過小RNA片段進入體內，促使mRNA快速降解，從而抑制相應蛋白的合成，特異性阻斷基因表達。資料顯示，RNA干擾技術可用于某些疾病的治療，特別是微生物、線蟲、動植物等生物體功能基因的驗證[12]。本實驗室在前期研究中已成功構建了TRPV6的RNA干擾質粒pSIREN-TRPV6-3，本試驗對pSIREN-TRPV6-3進行酶切與測序鑒定，結果理想，表明重組質粒擴培成功，這為下一步研究體內干擾TRPV6表達提供了可能。

目前，國內外對病毒方式的基因轉染的改進做了大量的研究，但病毒載體如腺病毒載體，已證實存在安全性問題，特別是免疫原性和細胞毒性方面[13]。相比較而言，非病毒載體無細胞毒性和免疫原性，是體內轉染較理想的方式。基因轉染需要一定的轉染試劑作為載體進入細胞。目前應用最為廣泛的是陽離子脂質體和陽離子聚合物，它們可透過細胞屏障，將目的基因轉入細胞內。但是，陽離子脂質體在體內試驗中，會被快速清除，并誘發抗炎反應，從而使其使用受到限制[11]。陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)，因其分子結構特點可穩定地與DNA結合，并可透過細胞膜進入細胞，安全性高[14]，并且PEI相對于陽離子脂質體來說價格便宜，有利于大量的體內試驗，故筆者選擇更為安全的PEI作為轉染載體。試驗結果表明，重組質粒與PEI混合溶液注射蛋雞后，在第7天就可在十二指腸和空腸檢測到較高水平的重組質粒的表達，且可穩定地持續至第21天。結果充分表明，本試驗采用PEI轉染試劑和重組質粒轉染效率較高，為研究TRPV6在蛋雞腸道功能的作用夯實了基礎。

3.2 TRPV6基因沉默對十二指腸和空腸鈣離子轉運相關蛋白表達的影響

家禽的腸鈣吸收主要發生在小腸前段即十二指腸和空腸段[15]。本課題組前期研究中，成功地在蛋雞小腸組織中擴增出TRPV6、CaBP-D28K及PMCA1b， 且TRPV6的表達量在十二指腸最高，其次是空腸，而CaBP-D28K和PMCA1b在十二指腸、空腸、回腸段表達量均較高[9]，這表明小腸是蛋雞鈣離子轉運的主要部位。同時NCX1作為鈣離子排出細胞的第二轉運系統，主要分布于小腸等鈣轉運相關組織。本試驗結果表明，注射pSIREN-TRPV6-3干擾質粒，十二指腸和空腸中的TRPV6、CaBP-D28K基因和蛋白表達均顯著降低，且在第14 天抑制效果最高，PMCA1b和NCX1表達量不發生改變。表明TRPV6可以調控腸道中CaBP-D28K的表達，但不影響PMCA1b和NCX1的表達。體外研究表明TRPV6對鈣離子的轉運作用有限[16]。實驗室前期研究表明，轉染TRPV6基因沉默質粒成骨細胞TRPV6和CaBP-D28K表達降低，PMCA1b和NCX1的表達未受影響，與本研究結果一致。其他研究表明，CaBP-D9K和TRPV6單或雙敲除的小鼠，十二指腸和腎中PMCA1b表達無顯著變化[8]。綜合這些研究表明在小腸段TRPV6對CaBP-D28K具有調控作用，但是PMCA1b和NCX1表達變化不顯著。

3.3 TRPV6基因沉默對蛋雞血漿鈣、磷濃度、PTH水平及骨密度的影響

腸道對鈣離子的吸收并不能滿足蛋殼鈣化的大量鈣的需求。研究顯示，在腺胃中的食糜離開腺胃后在約75～78 min內，大部分的鈣離子在腸道前段被吸收[17-18]。在蛋雞腸道內鈣離子幾乎排空的情況下，蛋殼鈣化所需的鈣離子主要是來自髓質骨中鈣離子的轉換。這部分鈣占蛋殼總沉積鈣的20%～40%[19]。髓質骨中缺失的鈣，主要是由腸道從日糧中吸收鈣來補充。故高產蛋雞每天蛋殼鈣化需要的鈣離子主要是來自腸道吸收。甲狀旁腺激素(PTH)是甲狀旁腺細胞分泌的，可對小腸、腎和骨等組織器官產生效應，其主要作用是保持體內鈣的平衡，調節蛋殼形成和神經肌肉收縮等機能。本研究注射pSIREN-TRPV6-3干擾質粒，血漿鈣、磷濃度未發生改變，PTH水平升高，與腸道TRPV6和CaBP-D28K表達正好相反，在第14天顯著降低，表明腸道TRPV6基因沉默后，機體通過動員PTH等鈣調激素分泌，作用于腎和骨骼的代償機制可保證正常的血鈣水平。蛋殼鈣一部分來源于白天腸道對日糧鈣的吸收，一部分來源于夜間髓質骨中鈣離子的轉換，而髓質骨中缺失的鈣，也主要是由腸道從日糧中吸收鈣來補充，而一旦腸道鈣離子吸收障礙，極易導致髓質骨中鈣含量下降，骨質疏松、骨折等疾病的發生，本研究中股骨和脛骨密度沒有變化，提示以TRPV6為“門控”通道的鈣離子跨細胞轉運可能不是調控蛋雞腸道鈣離子吸收的主要途徑，但其確切機制有待進一步研究。

4 結 論

高產蛋雞在肌肉注射pSIREN-TRPV6-3干擾質粒后，在十二指腸和空腸部位成功轉染，顯著抑制腸道TRPV6和CaBP-D28K的表達，在轉染后第14天到達作用頂峰，但不影響腸道PMCA1b和NCX1表達及血鈣、血磷濃度，血液PTH水平代償性提高。綜合分析，TRPV6能調控腸道CaBP-D28K蛋白表達，但在正常日糧鈣水平條件下，沉默TRPV6通道蛋白不影響蛋雞體內正常的鈣轉運。