竹根七藥材質量標準研究*

郭 琳，李玉澤，毛昭琦，熱薩來提，宋小妹，崔九成，范少敏△

1.陜西中醫藥大學第二附屬醫院(咸陽 712000)，2.西北大學生命科學學院(西安710069)，3.陜西中醫藥大學(咸陽 712046)

主題詞 中藥學 竹根七 質量控制

竹根七為百合科開口箭屬植物開口箭(Tupistra chinensis baker.)的根莖。生于海拔1000～2000m的林下陰濕處、溪邊或路旁。分布于陜西、湖北、江西、福建、浙江等地，陜西以秦嶺以南的平利、洛南、鎮坪、眉縣分布較多，全年可采。多作為民族或民間用藥，性寒，味微苦、辛，具有清熱解毒，祛風除濕，散瘀止痛等功效，用來治療頭痛咳嗽、咽喉腫痛，風濕關節痛和跌打損傷等病癥[1-5]。現代研究表明甾體皂苷類為竹根七的主要化學成分[6]，竹根七提取物具有抗炎、抗腫瘤和抑菌等[7-12]藥理作用，2015版《陜西省藥材標準》收錄的竹根七標準未采用高效液相法進行含量測定，在薄層鑒別中選取的對照品具有一定局限性，本文在對竹根七進行系統化學成分研究的基礎上，從竹根七的植物形態、藥材性狀、顯微特征、TLC 法鑒別、HPLC 法測定含量和指紋圖譜等方面，建立竹根七藥材的質量評價體系，為藥材的質量規范和臨床療效保證提供科學依據。

材料與方法

1 材 料

1.1 藥材:竹根七分別購于陜西漢中，陜西眉縣紅河谷，寶雞鳳縣等地，經陜西中醫藥大學生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為百合科開口箭屬植物開口箭Tupistra chiensis Baker.的干燥根及根莖。

1.2 儀器及試劑:高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695，2998PDA檢測器)(美國waters公司)；GB204電子天平(精密度0.1 mg)；HHS2I-8電熱恒溫水浴鍋；舒美KQ-500DE型超聲波清洗儀；K101-0ES型電熱鼓風干燥箱；200-JRAB型高速萬能粉碎機；顯微鏡DMBH200，微型計算機(型號：啟天M430E；批號：P580A2717042)。乙腈為色譜純; 其余均為分析純; 水為娃哈哈純凈水; 對照品 Tupistroside E 為實驗室自制, 經 HPLC 檢驗，純度>98%，符合含量測定要求。

2 方 法

2.1 植物形態:其原植物開口箭為多年生草本。根狀莖長，圓柱形，直徑1～1.5 cm，多節，綠色至黃色。葉基生，4～12枚，近革質或紙質，倒披針形、條狀披針形，長15～65 cm，寬1.5～9.5 cm，先端漸尖，基部漸狹，鞘葉2枚披針形或距圓形，長2.5～10 cm。穗狀花序直立，少有彎曲，密生多花，2.5～9 cm；總花梗短，長1～6 cm；花短鐘狀，長5～7cm，花被筒長2-2.5 cm；裂片卵形，先端漸尖，長3～5 cm，寬約2～4 cm，肉質，黃色或黃綠色；花絲基部擴大，其擴大部分有的貼生于花被片上，有的彼此連合，花絲上部分離，長1～2 cm，內彎，花藥卵形；子房近球形，直徑2.5 mm，花柱不明顯，柱頭墩三棱形，頂端三裂。漿果球形，熟時紫紅色，直徑8～10 mm。花期7～8月，果期8～10月[3]。

2.2 性狀:根莖扁圓柱形，略彎曲，長10-15 cm, 直徑1-1.8 cm，節明顯，略膨大，節處有芽及膜質鱗片狀葉，節間短。表面黃棕色或黃綠色，有縱皺紋，節處有明顯的環狀皺紋，并散有圓點狀的須根痕。質略硬，易折斷，斷面淺黃白色，細顆粒狀。無臭，味微甘而苦澀。

2.3 顯微特征:粉末：黃白色。淀粉粒稀少 ，單粒類圓形，臍點、層紋不明顯，草酸鈣針晶成束或散在。螺紋、梯紋導管多見，偶見網紋導管。殘留基生葉表皮細胞長條形或長多角形，垂周壁連珠狀增厚。

3 結 果

3.1 薄層色譜鑒別:精密稱取竹根七粉末1.0 g，置于100 ml具塞錐形瓶中，然后加20 ml的60%甲醇水，加熱回流提取1.5 h，濾液蒸干，殘渣加水20 ml溶解,用水飽和正丁醇萃取3次后合并萃取液蒸干, 浸膏加入2 ml甲醇溶解,作為供試品溶液。另取鄰苯二甲酸二丁酯和Tupistroside E 對照品，用甲醇溶解后，制成每1 ml含2.0 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)實驗,吸取上述溶液各3 μL，分別點于硅膠GF254 薄層板上，展開劑采用三氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)下層液，取出晾干后噴10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品在與對照品色譜相應的位置上顯示相同顏色的斑點，見圖1。

注：A為254 nm波長下觀察，B為日光下觀察；1對照品鄰苯二甲酸二丁酯，2紅河谷，3漢中，4鳳縣，5 Tupistroside E供試品

圖1 竹根七供試品及對照品薄層色譜

3.2 含量測定

3.2.1 色譜條件：依利特 Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm )色譜柱; 柱溫30℃; 流速1 ml/min。流動相為乙腈( A)-水(B )梯度流動相, 檢測波長203 nm;見表1。在該色譜條件下，Tupistroside E對照品保留時間約為21.87 min，3種產地供試品色譜Tupistroside E峰與雜峰分離良好。色譜圖見圖2。

3.2.2 對照品溶液和供試品溶液制備：精密稱取Tupistroside E對照品5.7 mg，置于10 ml 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度，配制成含Tupistroside E 0.57 mg/ml的溶液，經0. 45 μm濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。精密稱取竹根七粉末約0.5 g，放入具塞錐形瓶中，加入10 ml的60%甲醇水,稱重，超聲1 h(功率 250 W，頻率40 k Hz)后，再次稱重，放冷并補足重量，用0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

表1 梯度洗脫程序

圖2 對照品(A)與供試品溶液(B)的色譜圖

3.2.3 標準曲線的制備：分別精密吸取Tupistroside E對照品溶液5，10，15，20，25，30，40 μL，每體積進樣3次，按上述色譜條件測定峰面積。橫坐標為進樣量質量(X, μg), 縱坐標為色譜峰面積( Y, AU ) ，進行線性回歸。得對照品Tupistroside E的回歸方程 Y=184190X+8090.2，r=0.9996，線性范圍為2.85～ 23.00 μg。

3.2.4 精密度、穩定性和重復性試驗：吸取標準品溶液10 μL進樣，按照色譜條件,重復進樣6次，測定Tupistroside E峰面積，RSD為1.01%，結果表明儀器精密度良好；精密吸取供試品溶液20 μL，分別在0，1, 2，4，8, 16, 24 h 進樣分析, 照色譜條件測定色譜峰峰面積，結果Tupistroside E峰面積的RSD為0.63%，表明樣品溶液在配制后24 h內穩定，取同一批次藥材，平行稱取6份，按方法制備供試品溶液, 照色譜條件測定Tupistroside E含量，結果表明本法重復性較好，RSD為1.17%。

3.2.5 加樣回收試驗：稱取已知含量的樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入Tupistroside E對照品適量，制備供試品溶液, 照色譜條件測定Tupistroside E含量。計算回收率，結果見表2。樣品含量測定：稱取3種產地竹根七藥材粉末各3 份(過4號篩，低溫烘干至恒重)，每份約0.5 g，按照制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液15 μL，根據外標法計算不同產地竹根七(紅河谷，漢中和鳳縣)中Tupistroside E的含量分別為3.078 %，3.010 % 和3.724 %(n=3)。

3.3 指紋圖譜研究

3.3.1 竹根七藥材樣品來源：10 批竹根七藥材編號S1 ～ S10，其中，S1 ～ S4 號采自陜西紅河谷，S5 號采自陜西鳳縣，S6產自甘肅西山、S7 產自陜西漢中、S8 產自陜西太白、S9 產自四川、S10 產自陜西眉縣，經陜西中醫藥大學生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為百合科開口箭屬植物開口箭Tupisra chiensis Baker.的干燥根及根莖。

表2 加樣回收率實驗

3.3.2 供試品溶液制備：精密稱取竹根七粉末(過5號篩)約0.5 g，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 ml，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率 60 kHz)45 min，放冷，稱重，用甲醇補足重量，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，作為供試品溶液，即得。

3.3.3 色譜條件：色譜柱為 Thermo HyPURITY C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A相) 和水(B相)為流動相，梯度洗脫條件：0～25min, 15%→23%A, 25～30min, 23%→24%A,30～36min, 24%→24%A, 36～40min, 24%→28%A,40～55min, 28%→34%A,55～60min, 34%→40%A,60～64min, 40%→60%A,；柱溫為25℃；檢測波長為 203 nm；流速為1ml/min；進樣量為10 μL。

3.3.4 精密度、重復性和穩定性試驗：精密吸取同一樣品的供試品溶液，連續進樣6次，結果各共有峰與內參比峰相對保留時間的RSD均低于0.3%，相對峰面積的RSD均低于3.0%。 表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的要求。取同一批藥材樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按項下色譜條件進行分析。結果各共有峰與內參比峰的相對保留時間的RSD均低于0.3%，相對峰面積的RSD均低于3.0%，表明方法重現性良好。 精密吸取同一樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，結果各色譜峰相對保留時間的RSD均低于0.2%，相對峰面積的RSD均低于3.0%，符合指紋圖譜的要求，且各時間點色譜圖相似度均大于0.95，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

3.3.5 指紋圖譜建立：取10批不同產地的竹根七藥材樣品，約0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，按“色譜條件”項下色譜條件進樣測定，記錄 10批竹根七藥材的HPLC指紋圖譜。將其導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系2004A 版》軟件進行分析，以陜西紅河谷竹根七樣品(S05)的指紋圖譜為參照圖譜，以平均數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.2s，經多點校正、自動匹配后生成竹根七藥材指紋圖譜的共有模式R，并建立10批竹根七藥材的指紋圖譜，見圖3。

3.3.6 相似度評價：按國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”比較樣品的色譜圖和計算相對保留時間，對10批樣品指紋圖譜采用多點校正后進行自動匹生成對照圖譜，見圖4。計算10 批樣品的相似度，結果見表3。由相似度結果可知，以上樣品與對照譜相比較，除個別批次(如S5,S6,S9)外，其余相似度均達到0.88以上，藥材差異較小。

圖3 10批竹根七藥材的指紋圖譜圖4 竹根七共有峰HPLC標準圖譜

表3 10 批次樣品相似度評價

討 論

竹根七多年生草本，高25～50 cm。根莖連珠狀，粗1～1.5 cm。葉互生，具柄；葉片紙質，卵形、橢圓形或長圓狀披針形，長4～9 cm，寬2.3～4.5 cm，先端漸尖，基部鈍、寬楔形或稍心形，兩面無毛[13-16]。花1～2朵生于葉腋，白色，內帶紫色，稍俯垂；花梗長7～14mm；花被鐘形，長15～22 mm，花被筒長約為花被的2/5；副花冠裂片膜質，與花被裂互生，卵狀披針形，長約5 mm，先端通常2-3齒或2淺裂；雌蕊長8～9 mm，花柱與子房近等長。漿果近球形，直徑7～14 mm，具2～8顆種子。花期4-5月，果期11月。可用于治療勞傷風濕疼痛，虛咳多汗，產后虛弱，腰痛遺精，夜尿頻多等癥。《陜西中草藥》曰為除風濕，清熱瀉火，鎮痛止血，調經活血，滋陰補虛。治風濕性關節炎，腰腿疼痛，跌打損傷，勞傷，月經不調，骨蒸勞熱。

不同流動相的考察。為了最佳分離指標成分，分別用甲醇-水和乙腈-水等流動相體系進行洗脫，發現用乙腈-水洗脫基線平穩，分離度較高。最終發現采用乙腈-水體系，梯度(0～15 min, 15%～23% A; 15～33 min, 23%～38% A; 33～40 min, 38%～100% A; 40～45 min, 100%～100% A)洗脫，竹根七中主要成分甾體皂苷類化合物的色譜峰分離度最高。

液相檢測波長的確定[17-19]。竹根七皂苷的結構類型主要為甾體皂苷，對不同的檢測波長進行探索后發現該類化合物在紫外區末端有吸收，故本文選擇檢測波長λ=203 nm，在此色譜條件下，基線較為平穩，色譜峰峰型較好，而且色譜峰能達到基線分離。

采用薄層色譜有快速、簡便等特點。在對實驗條件的系統考查基礎上確立了竹根七薄層色譜條件，考察了三氯甲烷- 甲醇- 水、三氯甲烷 - 甲醇、石油醚- 乙酸乙酯等不同比例的展開系統，且經反復證明，薄層色譜(三氯甲烷：甲醇：水 =7：3：1) 下層液為展開劑展開，具有分離度高、斑點清晰、簡便易行等特點，可用于竹根七藥材的鑒別。3種產地竹根七中Tupistroside E含量測定結果來看，不同產地竹根七中Tupistroside E的含量有一定差異，其中陜西鳳縣最高，紅河谷其次，漢中最低。本實驗為其他成分的含量測定方法提供了參考。竹根七作為秦巴山區的道地藥材，是陜西“太白七藥”之一，被2015版《陜西省藥材標準》收錄，但它未采用高效液相法進行含量測定，在薄層鑒別中選取的對照品具有一定局限性，本課題組在系統研究竹根七化學成分基礎上，對竹根七的質量標準進行了升級。該方法簡便快速，分離度好，重現性好，準確度高，專屬性強，此次薄層鑒別及高效液相含量測定方法可為竹根七質量標準的制定提供強大依據。