siRNA降低MACC 1基因表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖凋亡及PI 3K/AKT信號通路的影響研究

周斌,孫博,呂會娟,艾亮,古雅麗

鄭州市婦幼保健院1產(chǎn)科,2檢驗(yàn)科,病理科3,鄭州4500000

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近些年的發(fā)病率呈上升趨勢,嚴(yán)重威脅女性的健康和生命.目前雖然子宮內(nèi)膜癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明了,但普遍認(rèn)為是多基因多步驟控制的復(fù)雜過程,由于細(xì)胞增殖與凋亡比例失衡,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[1].因此,探索引起子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及與腫瘤細(xì)胞增殖凋亡有關(guān)的特異性蛋白分子,對于該病的診斷及治療具有重要意義.結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1(metastasis associated in colon cancer 1,MACC1)是肝細(xì)胞生長因子/肝細(xì)胞生長因子受體(HGF/c-MET)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2],在結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中有重要作用.隨后有多項(xiàng)研究證實(shí)MACC1與胃癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)[3-5].MACC1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖凋亡的作用還未清楚.有研究發(fā)現(xiàn)MACC1在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào),與其發(fā)生、病理分期、組織分化程度、侵襲等相關(guān)[6].鑒于此,本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默子宮內(nèi)膜癌中MACC1基因的表達(dá),觀察細(xì)胞增殖及凋亡的變化,并進(jìn)一步研究相關(guān)的分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑和儀器

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa購自ATCC細(xì)胞庫,胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Hycloneo公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自Thermo公司;CCK8試劑盒購自上海生工有限公司,膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自華阜康生物科技股份有限公司,MACC1、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,cleaved caspase 3)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase,p-AKT)抗體均購自美國abcam公司,酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek公司,流式細(xì)胞儀購自美國Bio-Rad公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Ishikawa細(xì)胞在含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中的生長融合度約80%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代.傳2代以上即可用于實(shí)驗(yàn)研究.

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

Ishikawa細(xì)胞分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染合成的陰性對照siRNA)和MACC1轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染合成的MACC1-siRNA).取對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞,以2X105/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞達(dá)到85%生長融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟以LipofectamineTM2000說明書為標(biāo)準(zhǔn).

1.4 CCK 8法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的各處理組細(xì)胞,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔含細(xì)胞5X103個,每孔中加200 μl.分別在培養(yǎng)24、48、72 h時終止培養(yǎng).每孔加入CCK8試劑10 μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h,振蕩5 min后,全自動酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔細(xì)胞的光密度(optical density,OD)值.每組均設(shè)置5個復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

依據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作.取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照1.3分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液潤洗后制備成1X106/ml的單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況.

1.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞,經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%的脫脂奶粉于室溫下封閉1.5 h,分別加入 MACC1、PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT、GAPDH(均按照1∶1000稀釋)一抗,4℃孵育過夜后加入二抗,室溫孵育1.5 h,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminecence,ECL)進(jìn)行顯色.以GAPDH作為內(nèi)參,Quantity軟件分析蛋白條帶的灰度值,計算各蛋白的相對表達(dá)量.

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21-.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測

MACC1-siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞48 h后,Western blot法檢測各組細(xì)胞中MACC1的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,陰性對照組與空白對照組的MACC1蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);MACC1轉(zhuǎn)染組的MACC1蛋白相對表達(dá)量低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).(圖1、表1)

2.2 MACC 1-siRNA轉(zhuǎn)染對Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

MACC1-siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞24、48、72 h后,CCK8檢測各組細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染24 h時3組細(xì)胞OD490值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);轉(zhuǎn)染48 h和72 h時,MACC1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD490值均低于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).(表2)

表1 3組細(xì)胞中MACC 1蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

表1 3組細(xì)胞中MACC 1蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

0.577±0.056 0.568±0.051 0.172±0.021*77.919 0.000空白對照組陰性對照組MACC1轉(zhuǎn)染組F值P值MACC1蛋白相對表達(dá)量組別

表2 3組Ishikawa細(xì)胞OD490值的比較(±s)

表2 3組Ishikawa細(xì)胞OD490值的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

OD490值48 h 0.423±0.031 0.417±0.029 0.301±0.026*17.177 0.003 0.215±0.005 0.213±0.005 0.211±0.004 0.545 0.606 0.626±0.045 0.604±0.041 0.418±0.034*24.170 0.001空白對照組陰性對照組MACC1轉(zhuǎn)染組F值P值24 h 72 h組別

2.3 MACC 1-siRNA轉(zhuǎn)染對Ishikawa細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,MACC1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).(圖2、表3)±s)

表3 3組Ishikawa細(xì)胞凋亡率的比較(x-

2.4 MACC 1-siRNA轉(zhuǎn)染對Ishikawa細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白及PI 3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3,PI3K/AKT信號通路蛋白PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,MACC1轉(zhuǎn)染組PCNA、PI3K、p-AKT蛋白相對表達(dá)量均低于空白對照組,cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).(圖3、表4)

表4 3組Ishikawa細(xì)胞PCNA、cleavedcaspa se 3、PI 3 K、p-AKT蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

表4 3組Ishikawa細(xì)胞PCNA、cleavedcaspa se 3、PI 3 K、p-AKT蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組陰性對照組MACC1轉(zhuǎn)染組F值P值0.665±0.053 0.642±0.051 0.152±0.023*127.243 0.000 0.117±0.015 0.110±0.012 0.263±0.026*64.269 0.000 0.482±0.047 0.465±0.042 0.144±0.018*75.951 0.000 0.106±0.012 0.113±0.013 0.022±0.008*61.218 0.000 PCNA cleaved caspase 3PI3K p-AKT

3 討論

子宮內(nèi)膜癌病死率居婦科惡性腫瘤第3位,僅次于卵巢癌和宮頸癌,其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,目前還未研究清楚,但越來越多的研究顯示子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是一個與癌基因激活、抑癌基因失活有關(guān)的多基因多步驟的復(fù)雜過程[7].HGF/c-MET信號通路在多種惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生命活動過程[8].MACC1基因已被證實(shí)是HGF/c-MET信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,最早是在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn),可與c-MET啟動子結(jié)合,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生長等過程[9].有研究顯示,在肺癌、卵巢癌、膽囊癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)MACC1的存在,與細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)特性及預(yù)后密切相關(guān),卵巢癌中抑制MACC1的表達(dá)可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,并可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[10];非小細(xì)胞肺癌中抑制MACC1的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡[11];膽囊癌中下調(diào)MACC1的表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[12].本研究結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MACC1-siRNA,細(xì)胞的增殖能力降低,凋亡增加.這提示MACC1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.

細(xì)胞的增殖失控與凋亡失衡是引起腫瘤發(fā)生的重要原因,受到多種基因的調(diào)控.PCNA只在正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在,與細(xì)胞的DNA合成有密切聯(lián)系,是細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白,目前已在子宮內(nèi)膜癌、胃癌等多種腫瘤中檢測到高表達(dá)[13-14].細(xì)胞凋亡存在多條通路參與發(fā)生,其中caspase途徑在細(xì)胞凋亡過程中有重要作用,caspase 3作為caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最主要的蛋白酶,在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用,被稱為"死亡執(zhí)行蛋白酶",其被活化后可使凋亡進(jìn)入不可逆階段.目前已應(yīng)用于多種腫瘤凋亡的檢測指標(biāo)[15-16].PI3K/AKT信號通路是細(xì)胞內(nèi)一個重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與包括子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17].有研究顯示,子宮內(nèi)膜癌中PI3K/AKT信號通路處于激活狀態(tài),可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而抑制該信號通路后反之[18].PI3K下游有多種效應(yīng)分子,AKT是PI3K/AKT信號通路下游直接底物,AKT磷酸化后,可增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力,參與細(xì)胞的增殖及凋亡過程,可抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗凋亡作用.為了研究RNA干擾MACC1表達(dá)后引起細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制,本研究通過Western blot法檢測PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)抑制MACC1表達(dá)后PCNA、PI3K、p-AKT蛋白均下調(diào)表達(dá),cleaved caspase 3蛋白上調(diào)表達(dá).這提示抑制MACC1表達(dá)可通過調(diào)節(jié)PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖凋亡.

綜上所述,抑制MACC1基因表達(dá)可降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,上調(diào)cleaved caspase 3蛋白表達(dá),下調(diào)PCNA及PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá).這提示MACC1可能是臨床上子宮內(nèi)膜癌分子診斷及靶向治療的靶點(diǎn).后續(xù)研究中將檢測MACC1在子宮內(nèi)膜癌中的其他生物學(xué)特性,及從體內(nèi)研究進(jìn)行深入研究.