葡萄糖調節蛋白78在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及其對化療敏感性的影響

申鐵兵,郭立娜,李瓊,夏鳳君

內蒙古醫科大學附屬醫院口腔科,呼和浩特 0100500

口腔鱗狀細胞癌是中國目前發病率和病死率較高的頭頸部惡性腫瘤之一,嚴重威脅著人類的健康和生命.由于大多數口腔鱗狀細胞癌對放療不敏感,以及由于頜骨對放射線的阻擋,使放療效果不理想,因此,化療是口腔鱗狀細胞癌最主要的輔助治療手段[1],但是長期化療易導致腫瘤細胞產生耐藥性,從而影響化療效果[2].因此,如何提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性一直是腫瘤治療領域關注的重點.近年來,自噬性程序性細胞死亡引起越來越多細胞生物學家的關注[3].有研究顯示,內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反應與細胞自噬密切相關[4].其中,葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)是內質網管腔中最主要的多功能分子伴侶蛋白,參與調控未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)信號通路[5].近年來,有研究表明,GRP78在一些腫瘤細胞中呈高表達,對于腫瘤細胞對化療藥物的敏感性具有重要的影響[6],但目前關于GRP78在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達情況及其與化療藥物敏感性的相關性研究尚未見明確報道.本研究通過檢測GRP78在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中的表達水平,探討其對奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)誘導口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡的影響,旨在為提高口腔鱗狀細胞癌細胞的化療敏感性提供潛在的干預靶點.現報道如下.

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2017年12月于內蒙古醫科大學附屬醫院病理科存檔的38例口腔鱗狀細胞癌患者的口腔鱗狀細胞癌組織標本作為觀察組.38例患者中,男性21例,女性17例;年齡為26～78歲,平均年齡為(57.24±13.94)歲;高分化癌15例,中分化癌17例,低分化癌6例.另外,選擇口腔頜面外科唇裂修復術中丟棄的正常口腔黏膜組織作為對照組,正常口腔黏膜組織標本取自5例男性和5例女性,年齡為31～68歲,平均年齡為(54.50±11.07)歲.兩組標本來源者的性別和年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性.

1.2 細胞、試劑與儀器

人口腔鱗狀細胞癌細胞株Tca8113細胞購自American Type Culture Collection公司.L-OHP由齊魯制藥有限公司提供,引物以及siRNA干擾靶序列由上海生工生物工程有限公司合成并提供,SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司,cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒和細胞凋亡試劑盒均購于美國OMEGA生物公司,DMEM高糖細胞培養基和Opti-MEM培養液均購于美國GIBCO公司,0.25%胰蛋白酶-EDTA細胞消化液購于北京鈕因華信科技發展有限公司,胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗均購于美國ThermoFisher公司,Trizol和細胞轉染試劑LipofectamineTM2000均購于美國Invitrogen公司,GRP78抗體、蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,JAK2)抗體、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(phosphorylated protein tyrosine kinase 2,p-JAK2)抗體、信號轉導與轉錄因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抗體及磷酸化的信號轉導與轉錄因子3(phosphorylated signal transduction and transcription factor 3,p-STAT3)抗體均購于美國Abcam公司,辣根酶標記的二抗購于美國Epitomics公司,DEPC購于美國Sigma公司,磷酸鹽緩沖液、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)均購于國藥集團化學試劑有限公司,生理鹽水購于安徽雙鶴藥業有限責任公司.HERcell1501型CO2細胞培養箱購于美國Thermo Forma公司,Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機購于德國Eppndorf公司,DL-CJ-2ND超凈工作臺購于北京東聯哈爾儀器制造有限公司,實時定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司,iMake多功能酶標儀購于日本Bio-Rad公司,CX41倒置光學顯微鏡和OLSCKX53倒置熒光顯微鏡均購于日本OLYMPUS公司,電子分析天平購于上海玉研科學儀器有限公司,Amersham電泳儀購于瑞典Bioscience公司,恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉移電泳槽均購于北京六一儀器廠,FluorChem FC3凝膠成像數碼分析系統購于美國ProteinSimple公司.

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組織化學法 嚴格按照SP試劑盒說明書的步驟進行操作.隨機選擇10個視野,觀察GRP78的陽性表達情況.GRP78陽性判斷標準:以細胞質呈棕黃色染色判定為GRP78陽性表達.①陽性細胞染色強度評分標準:不著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;計算10個視野下的染色平均分值.②陽性細胞所占百分比評分標準:陽性細胞所占百分比為0,記0分;1%～25%,記1分;26%～50%,記2分;51%～75%,記3分;>75%,記4分.根據染色指數判定結果,染色指數=陽性細胞所占比例評分X細胞染色強度評分.根據染色指數將切片分為陰性(0～1分),弱陽性(2～5分),中陽性(6～10分),強陽性(>10分).弱陽性、中陽性和強陽性均為GRP78細胞陽性.

1.3.2 細胞培養 將Tca8113細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養.24～48 h更換培養液,48 h傳代一次.

1.3.3 耐藥細胞株的建立 經預實驗結果顯示,LOHP作用于Tca8113細胞半數抑制濃度(half inhibition concentration,IC50)為 19.44 μg/ml,取對數生長期細胞Tca8113,加入2 μg/m(l終濃度約為1/10 IC50)的L-OHP作用48 h后進行傳代,重復上述步驟孵育72 h后,棄上清;然后重復同樣的步驟,將L-OHP的終濃度提高一倍(L-OHP終濃度分別為2、3、4、5、6 μg/ml);直至Tca8113細胞可在5 μg/ml(終濃度約為1/4 IC50)L-OHP的作用環境下正常生存,然后以含加倍濃度(12～24 μg/ml)的大劑量LOHP對Tca8113細胞進行間斷誘導,從而成功獲得了生長良好的耐受24 μg/ml L-OHP的耐藥細胞株,命名為Tca8113-L-OHP.棄培養上清,采用無菌PBS沖洗3次后,加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中繼續培養.

1.3.4 MTT法 采用噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法檢測細胞增殖能力.將Tca8113細胞或者Tca8113-L-OHP耐藥株(1X104/孔)單層接種至96孔板中,置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養,加入32 μg/ml的LOHP,檢測Tca8113細胞和Tca8113-L-OHP細胞中JAK2/STAT3信號通路相關蛋白的表達.設置10個平行孔,24 h后,受試組細胞加入4、8、16、32、64 μg/m(l終濃度)L-OHP,而空白對照組細胞未作任何處理,繼續培養48 h后,每孔加入20 μl MTT,置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育4 h后,棄上清液,每孔加入200 μl DMSO,置于振動器上振蕩5 min,置于顯微鏡下觀察無紫色結晶物.將96孔板放置于酶標儀上,檢測波長為570 nm,參比波長為450 nm處的吸光度(absorbance,A)值,計算平均值.根據計算公式計算細胞增殖抑制率(inhibition rate,IR).IR(%)=(A空白對照組-A受試組)/A空白對照組X 100%.

1.3.5 細胞轉染 提前1天在相應備行轉染的6孔板上接種5X105個Tca8113-L-OHP細胞,分為2個實驗組:GRP78 siRNA轉染組和陰性對照組.培養24 h后,當融合度達到50%～60%時,按照脂質體轉染說明書進行轉染操作,在EP管中分別加入5 μl預先配置的GRP78 siRNA以及250 μl的無血清Opti-MEM培養基,混勻,室溫放置10 min;另外在5 μl LipofectamineTM2000 脂質體溶液中加入 250 μl無血清Opti-MEM培養液,振蕩混勻后,室溫放置10 min;將上述兩種溶液吹打混勻,室溫放置30 min;將脂質體-質粒DNA復合液滴加至孔板細胞表面,置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養24～48 h.陰性對照組的轉染方法與上述GRP78 siRNA的轉染方法一致,而轉染無關序列不同.未轉染的Tca8113-L-OHP細胞僅進行常規培養.提取Tca8113-L-OHP細胞RNA,驗證目的基因的相對表達量.

1.3.6 提取總RNA ①收集1X1010個細胞,置于EP管中;②加入1 ml預冷的Trizol,充分混合均勻,靜置5～10 min;③加入200 μl三氯甲烷,振蕩30 s,靜置5～10 min;④12000 r/min離心5 min,離心半徑為8 cm,取上清;⑤加入 500 μl異丙醇,振蕩 30 s,靜置5～10 min;⑥12000 r/min離心5 min,離心半徑為8 cm,棄上清;⑦加入1 ml的75%乙醇,振蕩30 s,12000 r/min離心5 min,離心半徑為8 cm,棄上清;⑧將EP管倒置于濾紙上,將RNA充分干燥;⑨加入20 μl的DEPC水溶解沉淀,分裝,置于-80℃保存備用.采用瓊脂凝膠電泳檢測RNA相對分子量;采用分光光度計檢測RNA濃度.

1.3.7 RNA反轉錄 嚴格按照試劑盒說明書的步驟進行操作.將cDNA置于-20℃的溫度下保存備用.

1.3.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chainreaction ,RT-PCR)將20 μl的反應體系置于37℃恒溫中水浴60 min,85℃5 s,加入去離子水至 100 μl,各反應孔取 2 μl進行 PCR.冰浴中配制20 μl PCR反應體系,95℃30 s預變性,95℃5 s,60℃30 s,共進行45個循環.根據美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數據庫獲得的資料設計引物序列,引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供.根據使用說明調整基線,將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分,從軟件中讀取Ct值.ΔCt=樣品 Ct均值-內參 Ct均值,ΔΔCt=ΔCt-(隨機陰性對照樣品Ct均值-內參Ct均值),以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達量.

1.3.9 蛋白質印跡法(Western blot)①提取蛋白樣品;②蛋白樣品凝膠電泳;③轉膜;④封閉;⑤加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗孵育;⑥加入二抗孵育;⑦顯影;⑧采用化學發光法檢測膜上的蛋白表達條帶,采用FluorChem FC3凝膠成像數碼分析系統進行定量分析,以積分光密度表示灰度值.

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對-數據進行統計分析.計量資料以均數±標準差()表示,組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用q檢驗.計數資料采用例數或率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法.以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 不同組織中GRP78的表達

口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78的陽性表達率為84.2%,高于正常口腔黏膜組織的20.0%,差異有統計學意義(P<0.05).高、中、低分化口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78的陽性表達率比較,差異無統計學意義(P>0.05);高、中、低分化口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78的陽性表達率均高于正常口腔黏膜組織(P<0.05).(表1、圖1)

表1 不同組織中GRP78蛋白的表達情況

2.2 Tca8113細胞和Tca8113-L-OHP細胞對LOHP的化療敏感性及GRP78的表達

經RT-PCR檢測結果顯示,Tca8113細胞中GRP78 mRNA的相對表達量為(0.29±0.04),明顯低于Tca8113-L-OHP細胞的(0.83±0.08),差異有統計學意義(t=19.092,P<0.01).經MTT法檢測,經不同濃度的L-OHP(4、8、16、32、64 μg/ml)處理后,Tca8113細胞的增殖能力明顯受到抑制,且隨著LOHP的濃度升高,對細胞增殖活性的抑制越明顯,Tca8113細胞的增殖抑制率明顯高于Tca8113-LOHP細胞,差異均有統計學意義(P<0.01)(表2).

表2 L-OHP對Tca8113和Tca8113-L-OHP細胞增殖活性的影響(%,±s)

表2 L-OHP對Tca8113和Tca8113-L-OHP細胞增殖活性的影響(%,±s)

縮略語:IR=細胞增殖抑制率

細胞Tca8113細胞Tca8113-L-OHP細胞t值P值IR 4 19.7±2.0 8.9±1.0 14.963 0.000 8 27.5±0.8 12.9±0.9 38.073 0.000 16 44.4±0.6 23.9±0.9 62.679 0.000 32 69.8±1.0 33.4±1.0 80.917 0.000 64 87.0±1.1 43.6±0.8 98.247 0.000

2.3 下調GRP78對Tca8113-L-OHP細胞對LOHP敏感性的影響

經不同濃度的L-OHP作用后,GRP78 siRNA組Tca8113-L-OHP細胞的增殖活性明顯低于陰性對照組,差異均有統計學意義(P<0.01).(表3)

表3 轉染GRP78 siRNA對Tca8113-L-OHP細胞增殖活性的影響(%,±s)

表3 轉染GRP78 siRNA對Tca8113-L-OHP細胞增殖活性的影響(%,±s)

縮略語:IR=細胞增殖抑制率

Tca8113-L-OHP細胞陰性對照組GRP78 siRNA組t值P值IR 4 9.1±0.9 21.4±1.2 25.41 0.000 8 13.2±1.0 32.5±1.0 42.54 0.000 16 23.0±0.8 50.3±0.9 75.27 0.000 32 32.2±1.2 75.4±0.8 99.13 0.000 64 44.9±1.3 91.4±1.1 88.39 0.000

2.4 Tca8113細胞和Tca8113-L-OHP細胞中JAK 2/STAT 3信號通路相關蛋白的表達

加入L-OHP后,Tca8113細胞中p-JAK2和p-STAT3 mRNA、p-JAK2和p-STAT3蛋白的相對表達量均低于Tca8113-L-OHP細胞,差異有統計學意義(P<0.05).經32 μg/ml的L-OHP作用后,與未加入L-OHP作用的Tca8113細胞相比,加入L-OHP Tca8113細胞中p-JAK2、p-STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白的相對表達量有所下調,差異均有統計學意義(P<0.05);但是加入L-OHP后,Tca8113細胞中JAK2、STAT3 mRNA和JAK2、STAT3蛋白相對表達量,以及Tca8113-L-OHP細胞中JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3的相對表達量與加入L-OHP前比較,差異均無統計學意義(P>0.05).(表4、表5)

表4 Tca8113細胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(±s)

表4 Tca8113細胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(±s)

加入L-OHP無有t值P值JAK2 mRNA 1.20±0.13 1.18±0.13 0.344 0.735蛋白0.92±0.12 0.95±0.15 0.494 0.627 p-JAK2 mRNA 0.38±0.07 0.20±0.08 5.355 0.000蛋白0.64±0.15 0.41±0.12 3.786 0.001 STAT3 mRNA 0.91±0.12 0.89±0.13 0.358 0.725蛋白0.64±0.08 0.67±0.10 0.741 0.468 p-STAT3 mRNA 0.45±0.10 0.18±0.04 7.927 0.000蛋白0.58±0.07 0.28±0.05 11.028 0.000

表5 Tca8113-L-OHP細胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(±s)

表5 Tca8113-L-OHP細胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(±s)

加入L-OHP無有t值P值1.16±0.18 1.14±0.20 0.235 0.817 0.94±0.14 0.98±0.12 0.686 0.502 0.71±0.11 0.65±0.12 1.166 0.259 1.05±0.17 1.02±0.14 0.431 0.672 0.92±0.10 0.94±0.13 0.386 0.704 0.66±0.09 0.69±0.10 0.705 0.490 0.62±0.06 0.61±0.05 0.405 0.690 0.45±0.07 0.44±0.05 0.368 0.718 JAK2 mRNA 蛋白p-JAK2 mRNA 蛋白STAT3 mRNA 蛋白p-STAT3 mRNA 蛋白

2.5 GRP78對JAK 2/STAT 3信號通路相關蛋白表達的影響

經RT-PCR和Western blot檢測,轉染GRP78 siRNA后,Tca8113-L-OHP細胞p-JAK2、p-STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白的相對表達量均明顯低于陰性對照組,差異均有統計學意義(P<0.01).(表6)

表6 Tca8113-L-OHP細胞中p-JAK、p-STAT 3的表達

3 討論

目前,臨床上關于頭頸部惡性腫瘤的治療方法仍以外科手術切除為主,配合化療和放療輔助治療.如何提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,盡量提高治療效果,減少不良反應的發生,是目前腫瘤治療領域一直關注的重點[7].由于腫瘤微環境發生較大變化,如缺氧、低糖、酸中毒、炎性反應等,從而導致ERS反應的發生[8].因此,一方面激活內質網上相應蛋白感受器STAT3、JAK2等將信號傳遞至細胞核,啟動UPR維持細胞內環境穩態;另一方面誘導內質網應激傳感器GRP78高表達,以提高內質網內對蛋白的折疊和加工能力[9].GRP78是熱休克蛋白家族成員之一,具有高度保守的結構域,主要參與調控UPR信號通路[10].有研究顯示,很多腫瘤細胞的GRP78呈高表達,并與細胞耐藥性密切相關[11].宋佳等[12]發現特異性下調GRP78的表達可增加肝癌細胞對厄洛替尼的敏感性.目前,已有研究證實GRP78在非小細胞肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞中的相對表達量上調[13],但是關于GRP78在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達及其與化療藥物耐藥性的相關性尚屬于空白領域,因此,本研究著重探討了GRP78與口腔鱗狀細胞癌對L-OHP耐藥性的關系以及對JAK/STAT信號通路的影響.

L-OHP屬于第三代鉑類藥物,其在口腔鱗狀細胞癌治療方面的臨床療效已經得到臨床的普遍認可[14],但是基于筆者多年的臨床經驗發現,很多患者在接受L-OHP治療一段時間后產生明顯的耐藥性,從而導致患者預后較差.因此,本研究對LOHP耐藥性與GRP78的關系展開一系列研究.本研究中,首先證實了口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78的陽性表達率高于正常口腔黏膜組織(P<0.05),提示口腔鱗狀細胞癌細胞的ERS表達升高,為了抵抗惡劣的腫瘤微環境的影響,GRP78的反饋性表達上調,避免細胞發生程序性死亡或凋亡.隨后本研究通過藥物濃度遞增間歇誘導法建立L-OPH耐藥細胞株,經RT-PCR法檢測結果發現,Tca8113細胞中GRP78 mRNA的相對表達量明顯低于Tca8113-L-OHP細胞(P<0.01);而且通過MTT法檢測結果也證實,L-OHP對Tca8113-L-OHP細胞增殖活性的抑制作用降低,提示Tca8113細胞對L-OHP的耐藥性產生可能與GRP78表達量上調有關.因此,進一步通過siRNA技術下調Tca8113-L-OHP細胞中GRP78基因的表達,經不同濃度的L-OHP作用后,對Tca8113-L-OHP細胞增殖活性的抑制作用較陰性對照組細胞明顯升高,因此,下調GRP78后,L-OHP誘導口腔鱗狀細胞癌細胞的凋亡率明顯上升,由此證明GRP78在口腔鱗狀細胞癌中具有保護作用,可作為提高化療敏感性的潛在干預靶點.

JAK/STAT信號轉導通路是腫瘤細胞增殖和轉移的重要調控途徑,大多數惡性腫瘤的發生、發展均與JAK、STAT的磷酸化有關,包括口腔鱗狀細胞癌.既往有研究證實,GRP78可通過激活STAT3促進胃癌細胞的增殖和遷移[15].本研究探討了LOHP對Tca8113和Tca8113耐藥細胞株中p-JAK2、p-STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量的影響,結果顯示L-OHP可以明顯抑制Tca8113細胞中p-JAK2和p-STAT3的表達,但是對Tca8113-L-OHP細胞的相對表達量未見明顯影響,提示JAK/STAT信號通路可能參與了L-OHP耐藥性的發生.因此本研究又進一步探討了GRP78對JAK/STAT信號通路的影響,結果顯示,轉染GRP78 siRNA后,Tca8113-L-OHP細胞中p-JAK2和p-STAT3的磷酸化水平明顯下調,提示GRP78可通過調控p-JAK2和p-STAT3的磷酸化水平而影響細胞對LOHP的敏感性.

綜上所述,GRP78在口腔鱗狀細胞癌組織中的相對表達量明顯高于正常口腔黏膜組織,并且在L-OHP耐藥細胞株中的表達上調,可能與L-OHP的耐藥性有關;下調GRP78的表達可降低JAK2和STAT3的磷酸化水平,從而提高口腔鱗狀細胞癌細胞對L-OHP的敏感性,提示GRP78可能是提高口腔鱗狀細胞癌細胞對化療藥物敏感性的潛在靶點.但是本研究尚處于實驗階段,距離藥物研發以及臨床應用還需要很長一段時間,關于在藥物作用下GRP78的表達變化以及確切的作用機制有待進一步研究.