炭疽芽孢苗誘導(dǎo)大鼠體液免疫的研究

任閃閃

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451100）

炭疽桿菌（Bacillus anthraci）屬于芽孢桿菌屬，炭疽桿菌是人類歷史上第一個被證實的病原細(xì)菌，該菌可以導(dǎo)致家畜、野生動物、人類的病原菌，其中人類的炭疽病是人畜共患.當(dāng)前，通過對炭疽疫苗的免疫保護(hù)機制的研究，我們知道對于炭疽病的免疫主要體內(nèi)通過體液免疫來完成，細(xì)胞免疫的作用主要是機體內(nèi)起到輔助作用.我們知道機體內(nèi)的體液免疫系統(tǒng)主要由參與體液免疫應(yīng)答的器官、細(xì)胞和一些分子來構(gòu)成.為了了解炭疽病疫苗在機體內(nèi)體液免疫的應(yīng)答機制問題，并且為后續(xù)疫苗的研究開發(fā)提供寶貴的經(jīng)驗，本文采用炭疽芽孢桿菌疫苗-A16R芽抱苗與分別從三個角度研究大鼠的脾臟、骨髓和外周血，研究感染炭疽病小鼠體液免疫應(yīng)答機制.

1 實驗材料及方法

1.1 主要材料

SD大鼠（許可證SCXK(湘)2014-0010），長沙天勤生物科技有限公司；酸水解酪蛋白，西安浩天生物工程有限公司；酵母提取物，青島藻藍(lán)生物科技有限公司；胰蛋白胨，山東玉寶生物科技有限公司；實驗用PA血清，實驗室自備；BCA蛋白測定試劑，上海歐金實業(yè)有限公司.

1.2 主要儀器

RP-1500型pH計，上海闊思電子有限公司；YM-COS-100C型恒溫?fù)u床，上海豫明儀器有限公司；TD-5A型低溫高速離心機，常州市萬豐儀器制造有限公司；LAB-F6型蠕動泵，保定申辰泵業(yè)有限公司；微量加樣器10-1000μL，上海啟閔生物科技有限公司；Hz-0008型電子天平，上海諾萱科學(xué)儀器有限公司；LRH-150BOD型恒溫培養(yǎng)箱，上海印溪儀器儀表有限公司.

2 炭疽A16R芽孢苗的制備

炭疽芽孢桿菌毒株A16R為本實驗室保存?zhèn)溆?檢查合格后，按照要求制備接種一批種子管，在4℃留存以備使用.

將種子管中移種到LB瓊脂平板中，在管中挑選合適的菌落接種到LB瓊脂斜面培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)18個小時，然后用無菌的生理鹽水潤洗，制備菌液，接種LB瓊脂培養(yǎng)基羅氏瓶，保證菌液可以平鋪在LB培養(yǎng)基的表面，保持該狀態(tài)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24個小時，然后在該狀態(tài)下溫度調(diào)整到28℃繼續(xù)培育8天，每天定期檢查涂片觀察芽孢生長情況，并且檢查培養(yǎng)基是否有雜菌生長以及觀察期變化.當(dāng)芽孢生成率＞90%以上時，這是停止培養(yǎng).通過生理鹽水潤洗菌苔，轉(zhuǎn)移滅菌.在50℃16h斷鏈，在75℃30min殺死繁殖體，然后加入與潤洗體積相同的滅菌甘油鹽水，最后取菌液接種平板、肉湯各一支，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育24h，便為炭疽芽孢苗制劑，將其分裝到等量小瓶中，保存在4℃恒溫冰柜內(nèi)[2].

3 炭疽A16R芽孢苗誘導(dǎo)SD大鼠ASCs的動態(tài)觀察

3.1 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠血清生成動態(tài)變化

表1 炭疽A16R芽孢苗SD大鼠血清生成動態(tài)變化

SD大鼠通過30天的誘導(dǎo)免疫之后，觀察了炭疽A16R芽孢苗一針免疫和二針免疫的動態(tài)變化，炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠血清IgG在免疫7天之后就被檢測出，隨著天數(shù)的增加抗體呈現(xiàn)上升狀態(tài)，可能與芽孢在大鼠體內(nèi)不斷增值有關(guān)，二針免疫之后3天和7天抗體效價緩慢上升，在14和30天之后上升明顯（P＜0.05）.

3.2 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠脾臟ASCs生成動態(tài)變化

炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠脾臟的分泌細(xì)胞ASCs在一針免疫之后7天時可以檢測到，在14天時SD大鼠脾臟的分泌細(xì)胞ASCs明顯升高，30天時SD大鼠脾臟的分泌細(xì)胞ASCs上升變緩（P＜0.05）；SD大鼠通過二針免疫之后脾臟的分泌細(xì)胞ASCs在3天時明顯上升，在14天時顯著上升（P＜0.01），通過二針免疫后30天時脾臟的分泌細(xì)胞ASCs下降到與對照組水平相近情況并且無顯著性差異（P＞0.05）.

表2 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠脾臟ASCs生成動態(tài)變化

3.3 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠骨髓ASCs生成動態(tài)變化

表3 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠骨髓ASCs生成動態(tài)變化

炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠骨髓的分泌細(xì)胞ASCs在一針免疫之后7天與14天時骨髓中ASC沒有檢測到，一針免疫之后在30天時可以檢測到少量SD大鼠骨髓的分泌細(xì)胞ASCs；通過二針免疫SD大鼠骨髓的分泌細(xì)胞ASCs在7天時明顯升高（P＜0.05），并在二針免疫SD大鼠骨髓的分泌細(xì)胞ASCs14天時顯著增加（P＜0.01），14天至30天緩慢降低達(dá)到與一針免疫30天時的免疫水平.

3.4 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠外周血ASCs生成動態(tài)變化

炭疽A16R芽孢苗免疫之后的SD大鼠外周血的分泌細(xì)胞ASCs在一針免疫之后在14天時被檢測出，30天時緩慢增加；在二針免疫之后SD大鼠外周血的分泌細(xì)胞ASCs3天時明顯上升（P＜0.05），但是在7天時外周血的分泌細(xì)胞ASCs3緩慢上升數(shù)目與3天時相差不大，14天時外周血的分泌細(xì)胞ASCs3明顯上升（P＜0.05）.

表4 炭疽A16R芽孢苗對免疫SD大鼠外周血ASCs生成動態(tài)變化

4 實驗結(jié)論

對炭疽A16R芽孢苗誘導(dǎo)SD大鼠ASCs的動態(tài)觀察，進(jìn)行了30天的免疫得出，炭疽A16R芽孢苗誘導(dǎo)SD大鼠ASCs的動態(tài)觀察中得出，每次二針免疫之后ASCs數(shù)量就會明顯上升，但是周期較短，大約經(jīng)過10天之后，ASCs數(shù)量就會下降.同時在SD大鼠的骨髓中的ASCs檢出的時間較晚，免疫一般是14天時才能在二針免疫時檢出.在二針免疫之后SD大鼠免疫效果都會有激發(fā)狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞的增殖數(shù)量進(jìn)行排序為外周血＞骨髓＞脾臟.以上從實驗中得出的結(jié)果還存在一些不足，但是通過以后得研究以期可以作為人用疫苗的一種評價方法.