應用高效液相色譜-質譜/質譜聯用技術檢測貝達喹啉血藥濃度

朱慧 劉忠泉 謝莉 郭少晨 王彬 付雷 陸宇

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)引發的慢性傳染病，在全球范圍廣泛流行，嚴重危害人類健康。據世界衛生組織(WHO)[1]2017年全球結核病報告，2016年世界范圍內約有1040萬例新發患者，估算全球耐多藥和單耐利福平結核病患者約60萬例，其中耐多藥結核病(MDR-TB)約占82%。2016年結核病仍然排在全部死亡原因中的前10位，約有167萬例死于結核病[1]。WHO估算2016年中國約有新發結核病患者89.5萬例，現有抗結核藥物不能滿足臨床治療需求，新型抗結核藥物的開發迫在眉睫。

貝達喹啉是首個被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市的治療MDR-TB的藥物。2016年12月，貝達喹啉在中國被批準上市。鑒于貝達喹啉有心臟QT間期延長等不良反應，WHO指南建議加強治療期間藥物不良反應檢測和監管，防止貝達喹啉濫用及耐藥性的產生[2-3]。對抗結核藥物進行血藥濃度監測(therapeutic drug monitoring，TDM)，是指導臨床個體化給藥的較好手段，對觀察藥物相互作用、減少藥物不良反應方面有著積極的作用[4-5]。關于貝達喹啉血藥濃度的檢測方法僅有國外的一篇報道，國內尚無相關報道[6]。本文針對貝達喹啉建立了快速、準確的高效液相色譜-質譜/質譜聯用(HPLC-MS/MS) 檢測方法，檢測臨床服用貝達喹啉患者的血藥濃度，以便及時了解患者服藥后的狀況，給醫生提供用藥指導，從而達到提高療效、降低不良反應的目的。

材料和方法

一、儀器與試劑

1200 型高效液相色譜系統購自美國Agilent 公司， 配備電噴霧(ESI) 離子源的G6410B 型三重串聯四極桿質譜儀, 其他設備還包括Milli Q 純水機，Mettler Teledo XS 105 型 1/10萬分析天平等。貝達喹啉(上海瀚香生物科技有限公司，產品批號20150317)；甲醇(美國Fisher 公司), 色譜純(產品批號086535)； 甲酸(分析純)； 水為去離子水。

二、方法

1. 對照品溶液的配制：精密稱取貝達喹啉10 mg, 溶于甲醇中配制成2 mg/ml 的儲備液，置-80 ℃冰箱內保存, 使用時稀釋至所需濃度。

2. 高效液相色譜條件：分析柱為Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)； 柱溫為 25 ℃； 流動相: 甲醇-水(含0.1% 甲酸, 5 mmol/L甲酸胺) (85∶15)； 流率: 0.3 ml/min；進樣量2 μl。樣品分析時間為3.0 min。

3. 質譜條件：離子化方式為電噴霧電離；離子極性為正離子；檢測方式采用多反應監測， 母離子和子離子分別為質荷比(m/z)555.2→58.3；質譜參數如下：毛細管電噴霧電壓(capillary) 為4 kV, 去溶劑氣溫度為 350 ℃，去溶劑氣體流率為10 L/min， 碰撞能(collision energy) 為80 eV。

4. 樣品處理方法及質控樣制備：健康人空白血漿室溫解凍后, 精密量取90 μl, 加入貝達喹啉對照品儲備液至總體積100 μl，制成終濃度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/ml的含藥血漿。旋渦混勻后加入乙腈溶液200 μl，旋渦振蕩混勻后，4 ℃，離心力13 800×g離心10 min，取上清液置于進樣瓶中，進樣2 μl 檢測。采用同樣的方法每日配制濃度為0.2、1.0、4.0 μg/ml的貝達喹啉含藥血漿各5份，連續3 d，作為低、中、高濃度的質量控制樣品，用以考察方法學的各項指標。

5. 樣品穩定性考察：(1) 室溫放置穩定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml)各3份, 室溫下放置4 h 后, 按方法項4處理、檢測。(2)凍融穩定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml), 凍存于-80 ℃冰箱內, 取出后室溫自然解凍； 再冷凍12～24 h, 重復循環2次, 得到3次凍融樣品, 按方法項4處理、檢測。(3)處理后樣品放置穩定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml)，按方法項4處理后, 室溫放置4 h 后再次檢測， 4 ℃放置24 h后再次檢測。(4)長期凍存穩定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml)，-80 ℃冰箱內保存1周，2周后按方法項4加入乙腈沉淀蛋白后離心，取上清進行檢測。

三、結核病患者血樣采集及前處理

對已入組“中國國家衛生和計劃生育委員會-比爾及梅琳達·蓋茨基金會結核病防治合作項目”的12例結核病患者進行血藥濃度檢測，患者來源于北京胸科醫院，服用貝達喹啉的劑量均為2周內，每日1次，每次400 mg；2周后，1周3次，每次200 mg，口服。簽署知情同意書后，患者于服藥5 h后采集靜脈血2 ml(峰濃度)，服藥前采集靜脈血2 ml(谷濃度)，兩種劑量各采集峰濃度和谷濃度血樣一次。血樣在4 ℃條件下，1348×g離心15 min，取上清100 μl 加入乙腈溶液200 μl；旋渦振蕩混勻后，在4 ℃ 條件下，13 800×g離心10 min，取上清液置于進樣瓶中，進樣2 μl 檢測。

結 果

一、檢測方法的特異性

空白血漿加入對照品的色譜圖見圖1。在本研究的測定條件下，采用高效LC-MS/MS聯用方法分析人血漿中貝達喹啉的濃度，其出峰時間為1.9 min 左右，6份人空白血漿來源于6名健康志愿者。圖1顯示，在貝達喹啉出峰處沒有吸收峰，說明空白血漿中沒有雜質對貝達喹啉的分離測定造成干擾。貝達喹啉分子結構及定量子離子結構見圖2， 母離子和定量子離子為m/z555.2→58.3。

二、標準曲線的建立

按照方法項4，配制標準曲線樣品。以藥物濃度(X)為橫坐標, 藥物峰面積(Y)為縱坐標, 進行加權回歸, 得回歸方程, 繪制標準曲線?？疾? d 內3條標準曲線，r均大于0.99， 1/X加權。貝達喹啉典型標準曲線方程為：

Y=166 617.845 806X-340.413 190r=0.998

在0.1～5.0 μg/mlY與X呈良好線性關系。

三、 HPLC-MS/MS檢測方法的精密度及準確度

相對標準偏差(RSD)=標準偏差(SD)/計算結果的算術平均值，表1中日內精密度是5次測量結果的RSD，日間精密度是15次測量結果的RSD，準確度=測量值/理論值。取方法項4配制的低、中、高濃度的質控樣品, 每濃度制作3個分析批，每一濃度每批5個樣品，日內平行測定5次，計算日內精密度；連測3 d，計算日間精密度。結果見表1。

圖1 空白血漿和含貝達喹啉(1.0 μg/ml)的血漿色譜圖

圖2 貝達喹啉的分子結構和定量離子結構

貝達喹啉濃度(μg/ml)精密度(%)日內(5份)日間(15份)準確度(%)0.23.429.8697.81.01.812.23107.04.01.923.73107.0

表2 不同條件下HPLC-MS/MS檢測3種濃度貝達喹啉的穩定性

表3 不同檢測指標采用HPLC-MS/MS檢測3種濃度貝達喹啉的效果

上述穩定性結果見表2, 在本研究考察的各種儲存條件下, 儲存樣品的測定值與理論值之間的偏差均符合要求(RSD小于10%，則符合要求), 說明樣品在這些條件下的穩定性良好。

四、 儲備液穩定性

用新配制的對照品溶液配制標準曲線, 外標法考察30 d 前配制的對照品儲備液(- 80 ℃保存), RSD小于10%，準確度在±15%以內，符合要求，說明貯備液在30 d 內保持穩定。

五、基質效應

分別配制對照品低、中、高濃度(0.2、1.0、4.0 μg/ml)各3 份。分別用3種方法制備(1、2、3組)，1組用流動相加入不同濃度貝達喹啉溶液配制，2組是用空白血漿加入2 倍體積乙腈沉淀蛋白后, 離心取上清(13 800×g離心10 min，同方法項4)，再加入不同濃度貝達喹啉溶液后制得。3組是用空白血漿加入不同濃度貝達喹啉, 乙腈沉淀蛋白后, 離心取上清制得(13 800×g離心10 min，同方法項4)。將1、2、3組的響應值分別用A、B、C表示，則基質效應=100%×B/A，萃取回收率=100%×C/B，方法效率=100%×C/A，結果見表3。

六、結核病患者血藥濃度的檢測

對12例患者穩態后的峰濃度(服藥后5 h)和谷濃度(服藥前)進行檢測。當服用400 mg，每日一次時，峰濃度為(3.17±1.14) μg/ml(1.48～4.82 μg/ml)，谷濃度為(1.12±0.64) μg/ml(0.22～2.32 μg/ml)；當劑量為200 mg，每周3次時，峰濃度為(2.01±0.87) μg/ml(0.70～3.97 μg/ml)，谷濃度為(0.65±0.30) μg/ml(0.19～1.12 μg/ml)。

討 論

貝達喹啉是近50年來第一個上市的抗結核新藥,屬二芳基喹啉類藥物，它通過抑制結核分枝桿菌三磷酸腺苷(ATP)合成酶而發揮抗結核治療作用，尤其在MDR-TB和廣泛耐藥結核病的治療中，貝達喹啉的重要地位日益凸顯[7-10]。自2013年WHO發布貝達喹啉可用于治療MDR-TB患者的暫行策略指導方案后，至少在46個國家用于MDR-TB患者的治療，數篇報道結果顯示，含貝達喹啉的治療方案可獲得良好的療效，提高痰結核分枝桿菌培養陰轉率[11-14]。

2016年12月，我國國家食品藥品監督管理總局批準將富馬酸貝達喹啉片作為聯合治療的一部分，用于成人(≥18歲)耐多藥肺結核的治療。貝達喹啉可使患者QT間期延長且有肝毒性，該產品說明書中黑框警告，警示患者和衛生保健專業人員該藥物可能影響心電活動，可能導致異常和潛在的致命心臟節律。WHO指南建議首劑服藥后2周進行相關監測，此后每月監測1次，直至1年；這就需要建立快速、便捷的檢測方法，對臨床患者的血藥濃度進行治療監測。

貝達喹啉結構中含有溴，早期有報道使用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法對其進行檢測[15-17]。Dou?a 等[18]用手性柱和紫外檢測器分析了貝達喹啉手性結構。而貝達喹啉的HPLC-MS/MS檢測方法，國內尚無報道。本實驗室配備AB 4000 QTRAP液質聯用儀及Agilent 1200-6410B 液質聯用儀，及多種C18分析柱，經多次預實驗，優化峰形及出峰時間，最終確定使用Agilent 1200-6410B液質聯用系統，ZORBAX SB-C18柱用于本實驗方法學的建立，標準曲線范圍參考文獻報道。本實驗需要樣本量較少，僅100 μl血漿即可完成數次檢測，且血漿樣本使用了簡便的溶劑沉淀去蛋白法；文獻[6]中使用去離子水-乙腈和緩沖液(含乙酸銨、乙酸和三氟乙酸)作為流動相的梯度洗脫法，本研究使用了相對便宜的甲醇溶液取代乙腈，也未加入三氟乙酸，更方便經濟；進樣量2 μl也小于文獻的5 μl；穩定性考察進樣器室溫即可，不用10 ℃控溫。采用本色譜法測定人血漿中貝達喹啉，其出峰時間為1.9 min左右，可以快速檢測大批量樣本，適用于貝達喹啉的臨床監測及藥代動力學研究。

“中國國家衛生和計劃生育委員會-比爾及梅琳達·蓋茨基金會結核病防治合作項目”在中國實施“抗結核新藥引入和保護機制項目”(NDIP項目)，項目在我國第一批6家醫院、第二批10家醫院使用富馬酸貝達喹啉全球捐贈項目的藥品。2018年2月24日，該項目第1例患者在北京胸科醫院納入。筆者對北京胸科醫院NDIP項目中患者貝達喹啉的血藥濃度進行了監測，目前臨床入組12例均進行檢測，共48份標本，檢測結果均在標準曲線范圍內，檢測方法應用良好。當每日服用貝達喹啉400 mg劑量時，5 h后血藥濃度最高可達4.82 μg/ml，谷濃度則在0.22 μg/ml～2.32 μg/ml間。由此可見，不同患者個體間差異較大，需要對臨床服用貝達喹啉的患者進行血藥濃度監測，對血藥濃度明顯增高的患者密切關注不良反應，對血藥濃度低下的患者可建議醫生調整給藥劑量。

本研究建立了貝達喹啉單一藥物的檢測方法，后期可以通過分析貝達喹啉的常用給藥方案，建立貝達喹啉和其他抗結核藥物的聯合檢測方法，以獲取更多的信息。隨著項目納入患者例數的增多，可獲取更多樣本開展監測，將獲得更多的數據并結合療效分析，為貝達喹啉的臨床應用提供更多的參考。

綜上所述，本研究建立了人血漿中貝達喹啉的快速、便捷的HPLC-MS/MS檢測方法，可用于臨床服用貝達喹啉的結核病患者的血藥濃度監測及藥代動力學研究。此外，本研究也是首次報道服用貝達喹啉患者的血藥峰濃度、谷濃度，可為臨床上貝達喹啉的應用提供一定參考。

由筆者目前的研究結果來看，患者的個體差異較大，雖然目前入組患者例數不多，但年齡、性別分布有一定代表性。隨著入組患者例數的增加，方法若有不完善處，在后續試驗中應加以完善。此方法能滿足目前臨床研究的需要。