穩定同位素標記多肽的合成及應用

孫 雯，徐仲杰，羅 勇

(1.上海化工研究院有限公司，上海 200062；2.國家同位素工程技術研究中心 上海分中心，上海 200062)

穩定同位素(2H、13C、15N和18O)標記多肽及蛋白質，作為定量蛋白質組學中的“化學標簽”，普遍應用于生物樣品的檢測及示蹤等領域。蛋白質組學的定量分析方法主要利用高分辨率質譜，將同位素標記和非標記多肽離子或者肽段離子分開，利用其檢測信號的強度值進行定量計算[1]。合成穩定同位素標記多肽的主要方法有生物合成法和化學合成法，其中生物合成法是在動物、植物、酶或者微生物生理代謝過程中對目標位點進行標記；化學合成法根據常規的化學反應原理，通過使用穩定同位素標記的常規試劑代替非標記的基礎試劑，利用化學合成的方法制備標記目標化合物[2]。

目前，隨著質譜技術的不斷發展，基于質譜技術的定量檢測方法逐漸發展成為生物分子量化關系研究的主流，其中同位素稀釋質譜法利用其定量的優勢在生物分子定量檢測中得到廣泛應用[3]。同位素稀釋質譜法通常采用富含某種重質同位素如2H、13C、15N和18O的試劑標記待測肽段內標物，由于內標肽段與待測肽段的質量數存在差異，因此在采用質譜進行測試時其譜圖上顯示為質荷比不同的兩個峰，兩個峰的間距由內標物被標記重質同位素的個數決定[4]。由于同位素稀釋質譜法中使用的穩定同位素標記內標化合物與待檢測的內源性生物分子結構、理化性質幾乎完全相同，其色譜、質譜行為也相同，因此可以有效消除基質干擾及樣品前處理過程對檢測回收率的影響，是一種準確、可靠的定量方法。基于生物樣品檢測的同位素稀釋質譜技術大多采用液相色譜-質譜聯用的方法，該方法充分結合了高效液相色譜的高選擇性和質譜的高靈敏度，在對穩定同位素標記多肽進行測定時無需衍生化，檢測流程簡單[5]。但穩定同位素標記的多肽類內標化合物合成困難，使其應用受到限制。本文結合近期國內外研究成果，對穩定同位素標記多肽的合成和應用進行綜述。

1 穩定同位素標記多肽的合成

1.1 生物合成法

1.1.1細胞代謝標記法 Oda等[6]在1999年最早采用細胞代謝標記多肽的方法，在大于96%15N豐度的環境中，輔助以半乳糖，在30 ℃條件下采用搖床培養酵母菌，獲得了15N標記的多肽，并且利用質譜中標記多肽和非標記多肽的質量比例準確測定了蛋白含量。此后，其他實驗室也采用類似方法用其他的細胞進行標記多肽的制備及檢測，如Conrads等[7]選擇的耐輻射球菌和老鼠B16黑色素瘤細胞，Lanquar等[8]選擇的阿拉伯芥細胞，Pan等[9]選擇的沼澤紅假單胞菌等。最為特別的是Ong等[10]采用13CD3-蛋氨酸為標記試劑，先轉化為13CD3-S-腺苷基甲硫氨酸，將其作為同位素的提供者，定量鑒定了59種甲基化蛋白。Phillip等[11]采用13C標記的L-賴氨酸和L-精氨酸為碳源，喂養倉鼠卵巢細胞，獲得13C 標記的人體免疫球蛋白(hIgG1)，其中13C標記的L-賴氨酸和L-精氨酸片段的豐度高于99%。Zinn等[12]采用13C6-亮氨酸和13C6,15N4-精氨酸為原料，制備得到13C6,15N4標記的多肽。Vidovic等[13]采用15NH4Cl為碳源喂養埃希氏桿菌，制備得到標記15N多肽，該制備方法產率高、易純化。Liang等[14]采用亮氨酸-D3為原料，培養HEK 293T細胞，獲得標記多肽。Jia等[15]采用15N標記的Leu、Arg、Asp、Asn、Tyr和His等為原料，利用無細胞蛋白質生物合成法制備得到了15N標記多肽。李舒偉等[16]公布了一種通過、快速和可擴展的方式來產生用于定量的標記肽段的方法，將需要合成的肽段與strep-tag(WSHPQFEK)整合，利用無細胞的蛋白合成系統合成，經過strep-tag的親和富集以及完全酶解后得到標記的目標肽段。

1.1.2高等真核生物標記法 2003年Albert Heck實驗室[17]制備了兩種15N標記的有機體，秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅。線蟲用15N標記的大腸桿菌喂養，果蠅幼蟲用15N標記的酵母菌喂養。秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅的15N同位素豐度≥95%，可以用于蛋白的定量研究。2004年John Yates 實驗室[18]公布了一種獲得15N標記的小鼠肝臟蛋白方法，通過給小鼠喂養輔以高豐度的15N藻類且無蛋白的食物，經代謝后獲得標記肝臟蛋白，并將其作為內標使用。Mylne等[19]采用給白花蛇舌草喂養0.026% (15NH4)2SO4和0.026% K15NO3，得到15N 標記的環肽化合物。Foldynová-Trantírková等[20]采用99.8%豐度的15N標記纈氨酸喂養蜥蜴利什曼原蟲，廉價高效地得到了15N標記多肽。

1.1.3酶催化標記法 利用酶解反應在多肽末端羧基上標記18O同位素是常用的方法。Desiderio等[21]采用蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽的五肽原料，在甲醇氯化氫和18O的體系中，于37 ℃下反應一定時間得到18O標記的蛋氨酸腦啡肽、亮氨酸腦啡肽以及兩者的酯化產物。Kristiansen等[22]采用胰蛋白酶在H218O條件下，水解膜組織獲得賴氨酸和精氨酸末端羧基被18O取代的多肽，用于診斷膽管癌。Fenselau等[23]采用絲氨酸蛋白酶做催化劑在 H218O條件下水解，得到18O標記多肽。Bantscheff[24]和Miyagi[25]通過酶水解裂分也制備得到了18O標記的多肽。18O同位素不僅可以通過酶水解加入還可以通過裂解后摻入。因此，蛋白質可以在普通的環境中先消化，得到肽的干混合物后H218O才會被加入[26]。Carreira等[27]以H218O為原料，采用微波法制備18O標記的多肽，提高了反應效率，反應時間從12～48 h縮短為30 min。李楠楠等[28]利用酶切產生的肽段溶液經冷凍干燥后加入H218O復溶，同時加入質量是底物1%的胰蛋白酶(H218O溶解)及最終質量濃度為1 g/L的RapigestTM SF。于微波條件下反應5 min，冷卻至室溫，循環30 min，得到18O同位素標記定量肽段。錢小紅等[29]采用18O化學標記與酶切入位點標記相結合的方法，發明了一種利用穩定同位素18O標記蛋白質組進行雙重定量的新方法，該方法在N端肽段及C端肽段全部標記的基礎上，實現采用兩種18O穩定同位素標記同一樣本。

1.2 化學合成法

1.2.1乙酰化標記 乙酰化作用或氨基的乙酰化反應標記方法簡單、有效。例如Ji等[30]采用3倍量的N-乙酰氧基-D3-丁二酰亞胺和1 g/L多肽在pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液中室溫反應4～5 h，經反相色譜分離后，得到了乙酰化-D3標記的多肽。合成路線圖示于圖1。

圖1 乙酰化標記氨基酸路線圖Fig.1 The synthesis route of acetylation labeling peptides

Zhang等[31]采用固定化的糖肽和丁二酰酸酐-D4反應制備得到乙酰化糖肽-D4。Hsu等[32]利用還原胺化的原理，以裸露氨基的多肽為原料和氘代甲醛-D2反應后，再經氰基硼氫化鈉還原得到二甲基-D4標記的多肽，合成路線圖示于圖2。

Boersema等[33]采用CD2O ,13CD2O為原料，二甲基化反應標記多肽，用于細胞和組織裂解物的研究。Raijmakers等[34]采用氘代甲醛為氘源，磷酸鹽為緩沖溶液，自動連續地制備標記多肽。

圖2 二甲基-D4標記多肽合成路線圖Fig.2 The synthesis route of dimethylation labeling peptides

1.2.2標記氨基酸縮合法 標記氨基酸縮合法采用穩定同位素D、13C、18O或15N標記的氨基酸為基礎原料，使用高效縮合劑與其他標記或非標記的氨基酸通過化學反應的方法合成穩定同位素標記多肽。

Breitung等[35]以13C/15N標記的Fmoc-苯丙氨酸為原料，以wang樹脂為基體，羧基以苯甲基-2-磺酰三硝基三氮唑(MSNT)為活化試劑，利用二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DIC/HOBt)作為縮合劑，采用固態合成的方法[36-38]，逐步和13C/15N標記的Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH反應后制備得到標記的NH2-Met-Leu-Phe-OH；還可以進一步與甲酸乙酯反應得到13C/15N標記的甲酰基-Met-Leu-Phe-OH[39]，反應過程中可以采用克萊恩氏試驗法保證產物的轉化率[40-41]。Dietz等[42]報道了一種簡便的氘標記絲氨酸二肽油脂合成方法，采用1-溴丁烷-D9為起始原料，經過格氏反應、烷基化、水解等10步反應制備得到絲氨酸二肽油脂-D9。Pedersen等[43]采用氘代三乙胺和Pd(0)為氘源，得到酪氨酸-D4，進而得到碘代-酪氨酸-D4-血管緊張肽(十肽)。Harris等[44]采用易于得到的二芐基保護[1,2,3,4,5-13C5, 2-15N1]-L-谷氨酸為起始原料，采用HBTU作為縮合劑，經過三步反應，高效地制備得到穩定同位素標記甘-脯-谷(GPE)三肽。Ghomashchi等[45]采用[1-13C, 2-13C, 3-13C,15N]-半胱氨酸、Fmoc-甘氨酸、wang樹脂等為原料，1-羥基苯并三唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)為縮合劑，室溫固相合成了[1-13C, 2-13C, 3-13C,15N]-半胱氨酸-谷胱甘肽。Voronin等[46]采用13C6,15N標記的亮氨酸為標記原料，采用CEM多肽合成儀，微波條件下高效合成了VVSV{L}TVLHQDWLNGK十六肽，具體結構示于圖3。

圖3 標記合成16肽結構圖
Fig.3 The chemical structure of labeling peptides

張亮等[47]介紹了一種穩定同位素15N標記八肽的合成方法，該方法采用固相合成，以Wang樹脂為載體、Fmoc保護的15N標記氨基酸為前體，逐步合成，粗品經剪切、純化后制得穩定同位素15N標記八肽，化學純度大于99%，同位素豐度大于97%；徐仲杰等[48]在專利中保護了一種穩定同位素標記α-乳白蛋白特征肽段(VGINYWLAHK)的合成方法，采用液相法進行合成，前體為標記纈氨酸，和經Fmoc保護的非標記或者標記甘氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺等氨基酸進行縮合、脫保護等一系列反應，得到穩定同位素標記的目標肽段，產品化學純度及同位素豐度均大于99%。在合成中不僅要考慮純度和收率，還要考慮工藝過程對目標產物豐度的影響。

穩定同位素標記試劑的豐度是決定試劑合成成敗的關鍵，要充分考慮合成試劑、反應條件、環境因素等的影響，根據目標產物的定位標記選擇合適的同位素原料以及合成路線。生物合成法制備同位素標記多肽，純度高，不存在旋光異構體，但菌種的專有性強，很難適合不同多肽的合成，菌種的選育周期長；有機合成法制備穩定同位素標記多肽，方法靈活，標記的位置多樣，豐度容易控制，但容易產生消旋化合物，需要進行拆分提純。在同位素標記多肽的制備中要充分考慮應用的需要，選擇合適的合成方法。

2 穩定同位素標記多肽的應用

2.1 蛋白質組學定量

2.1.1乳制品檢測 穩定同位素標記肽段是同位素稀釋質譜法的常用內標試劑，在乳制品的質量控制中發揮了重要作用，如Ke等[49]采用CEV*F*R、NI*CNI*SCDK、LSFNPTQL*EEQCHI*(V*Val-OH-13C5,15N,F*Phe-OH-13C9,15N,I*Ile-OH-13C6,15N,L*Leu-OH-13C6,15N)等12種同位素標記多肽做內標，建立了一種同時量化四種酪蛋白和兩種主要乳清蛋白的超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜分析方法，定量分析了山羊和綿羊奶產品中牛奶和牛乳清粉的摻雜比例，并將該方法成功應用于不同商業品牌的羊乳配方奶粉的測試，結果表明該方法表現出高的專一性和準確性。黃棣華[50]發明公開了一種氨基酸序列為LSQSKVL*PV*PQK的酪蛋白磷酸肽的內標肽，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的氨基酸殘基。選擇酪蛋白磷酸肽中的一種特征肽作為檢查目標，對奶制品中酪蛋白磷酸肽進行定量檢測，該特征肽在酪蛋白磷酸肽中最具代表性，含量相對穩定，再加入內標肽對結果進行校正，該方法的線性好、回收率高、準確性好。張京順[51]采用同位素稀釋質譜法，同時利用牛胰蛋白酶對總α-乳白蛋白、總牛乳鐵蛋白和總β-乳球蛋白進行酶解，并對其特異標簽肽進行優化，使其成為具有與待測蛋白本身相近酶解效率、色譜和質譜行為的內標物；通過蛋白與內標肽之間摩爾關系，實現對三種蛋白的準確定量，該方法測試條件下三種蛋白的平均回收率分別為95.8%～100.6%、92.04%～100.67%和92.04%～109.91%；結果表明，建立的方法操作簡便、準確度高、重現性及靈敏度好，適用于嬰幼兒食品以及乳制品中的總α-乳白蛋白、牛乳鐵蛋白和β-乳球蛋白含量的測試。

2.1.2生物蛋白定量 李楠楠等[28]建立了定量肽段串聯體蛋白質結合18O標記-多反應監測質譜對蛋白質進行絕對定量的新方法，該方法采用酶促18O同位素標記輕標表達的Qcon CAT蛋白質作為內標，通過對騰沖嗜熱厭氧菌中選定的蛋白肽段進行絕對含量測定，發現方法的相對標準偏差<20%，解決了穩定同位素標記細胞培養氨基酸(SILAC)技術中標記試劑價格昂貴的問題，同時也對蛋白質組學絕對定量方法的發展起了推動作用。Kilpatrick等[52]采用同位素稀釋質譜建立了準確定量人體血清中C反應蛋白的方法，該方法以15N標記人體C反應蛋白為內標，與商品化的C反應蛋白檢測方法相比，更準確地監測人體健康狀況。Konopka等[53]基于定量蛋白質組學同位素稀釋質譜法以完整的標記蛋白做內標，對16對同位素標記和非標記的肽段進行準確定量，在常用的非標記與標記肽段質量比例計算的基礎上，探討蛋白摩爾比計算方法。Burkitt等[54]將基于肽段的同位素稀釋質譜法應用到蛋白質絕對定量研究中，通過使用已知純度的氨基酸標準物質對肽段的絕對含量進行測定，使蛋白質的測定結果可溯源至國際單位制(SI)。李舒偉等[16]發明了一種應用于蛋白質多反應監測的穩定同位素標記肽段合成及定量方法，通過對已知蛋白的代表性的肽段進行母離子/子離子的選擇，在待分析物中加入已知量的同位素標記內標肽段并結合其標準曲線，實現對某個或某些目標蛋白的絕對定量。

2.1.3蛋白測序及藥物代謝 Kaiser等[55]采用D7-VHLTPE和 D7-1-deoxyfructosyl-VHLTPE做內標，建立了血紅蛋白A1c測序的基礎方法，通過與國際臨床化學聯合會(IFCC)指定方法對比，相對偏差為3.4%，相對擴展不確定度為4.9%，絕對偏差為(0.5～3.9) mmol/mol(0.05%～0.35%)。張麗華等[56]發明了一種基于多肽兩端非等重穩定同位素標記的蛋白質氨基酸序列從頭測序方法，使用含有同位素標記賴氨酸的培養液實現對蛋白質中賴氨酸的標記，利用高效液相色譜-質譜進行分離和鑒定。劉喜東等[57]采用質譜法以酶切型穩定同位素標記肽段做內標，分別采用在酶解前加入帶酶切位點的標記肽段、不帶酶切位點的標記肽段及在酶解過程后、質譜檢測前加入不帶酶切位點的標記肽段進行樣品前處理；結果表明，采取第一種方式處理樣品可減小蛋白質絕對定量分析的誤差，使測定結果更接近真實值，提高了分析結果的重現性。Ong等[58]研究了采用穩定同位素標記細胞培養氨基酸法完全取代13C標記精氨酸，用氘代亮氨酸作為標記物對肌肉組織蛋白質進行代謝標記，對肌肉分化過程中蛋白質的變化進行定量。

2.2 食品過敏原檢測

當前，過敏性疾病已成為全球新的問題，據統計，90%左右的食品過敏反應是由花生、乳制品、小麥、海鮮、大豆等8類食物引起，其中花生引起的過敏反應居多，因此對食品過敏原進行篩選并準確定量意義重大。Sepp?l?等[59]將同位素稀釋質譜法應用到梯牧草花粉過敏原的絕對定量中，該研究使用高分辨、高精確質譜，使測定結果的日間變異系數小于5%。Careri等[60]采用液相色譜串聯質譜法，以生物標記肽段做內標，用于確定和量化食品中的花生蛋白過敏原Arah2和Arah3/4，在對四種生物標記多肽的選擇性進行考察的基礎上，優化了花生蛋白過敏原Arah2及Arah3/4色譜、質譜測試條件。同時采用液相色譜-串聯三重四極桿質譜法對食品基質米脆和巧克力中的Arah2與Arah3/4進行檢測，獲得良好的檢測限。Newsome等[61]以完整的牛15N-α-S1-casein做內標，在質譜選擇反應監測(SRM)模式下對烘焙用材料(包括動植物油、糖、食用膠)中牛奶蛋白進行測試。Weber等[62]利用液相色譜-串聯四極桿質譜建立了測定食品基質中酪蛋白的方法，該方法采用同位素標記酪蛋白做內標，以胰蛋白酶消化食品基質提取液，用于檢測牛奶過敏原。Shefcheck等[63-64]采用液相色譜串聯四級桿質譜，建立了冰淇淋基質中生物標記肽過敏原的檢測方法；并將該方法應用于含有不同水平花生蛋白的冰淇淋樣品檢測中，實驗表明，該方法對花生過敏原蛋白Arah1的定量檢測限為10 μg/g。同時使用相似方法，通過對巧克力樣品前處理技術的改進和樣品量的增加使花生蛋白的檢出限降低到2 ppm。王洋[65]采用同位素稀釋質譜法，以13C5-脯氨酸、13C5-纈氨酸及13C5-苯丙氨酸做內標，對蛋白質過敏原純品的含量測定方法進行研究，同時驗證了采用同位素稀釋質譜法測定β-乳球蛋白、β-酪蛋白、乳鐵蛋白及溶菌酶純品蛋白含量的準確性，且其測定結果可溯源到SI。

3 小結

隨著同位素稀釋質譜技術的不斷發展及在蛋白質檢測中的廣泛應用，穩定同位素標記多肽和蛋白質的研制，將進一步推動多肽的精準定量，同時降低分離難度，有效消除基質干擾，提高測定結果的準確性，該檢測方法將有望納入法規和標準。標記多肽及蛋白質作為內標物質在食品檢測、生物蛋白定量、蛋白測序、藥物代謝、過敏原檢測等領域的廣泛應用，將會進一步推動穩定同位素標簽技術在新藥研發、臨床病理、蛋白質組學、食品安全等領域的快速發展。例如在食品過敏原的檢測中，基于同位素稀釋技術的蛋白質組學方法正被用于廣泛替代傳統的免疫化學法；而在代謝組學中由于穩定同位素標記示蹤技術，能夠隨時追蹤含有同位素標記的多肽在體內或體外位置及數量的變化情況，被廣泛應用于臨床醫學中。因此，針對不同領域的需求開展穩定同位素標記多肽合成技術的研究在未來將大有可為。