肽基脯氨酰異構酶Pin1在動脈粥樣硬化的血管平滑肌細胞衰老中的作用

張雪 呂磊 王鵬 袁凱 李茂然 張紀蔚 孟秋蓉 梁衛

1上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院南院科（上海 201112）；2上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院（上海200127）

細胞衰老限制了正常細胞的增殖，表現出一系列形態學和生理學上的改變，如細胞形態增大而扁平、酸性β-半乳糖苷酶活性增強以及基因表達模式改變［1-2］。動脈粥樣硬化被認為是慢性炎癥性疾病，許多潛在機制參與其中，眾多證據表明血管細胞的衰老及凋亡在動脈粥樣硬化中起重要作用［3-4］。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作為血管壁固有的最豐富的細胞，在動脈粥樣硬化的病理進程中扮演主要角色［5-6］。

肽基脯氨酰異構酶（peptidyl-proplyl Isomerase，Pin1）是唯一能使特定的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白肽鍵發生異構的酶，能誘導靶蛋白發生構像改變，代表了一種新的蛋白質功能調節信號傳導機制。該機制被嚴格控制，只在某一范圍內的生理及病理情況下發揮作用［7-8］。Pin1發揮分子計時器的功能，嚴格控制細胞周期進程及細胞分裂，進而調節細胞衰老［1，9］。研究表明，Pin1在阿爾茨海默病和許多癌癥的發病機理中充當重要的調節因子［10］。本課題組研究揭示，Pin1在調節VSMCs增殖中發揮促進作用［11-12］，但其在VSMCs衰老中的作用還未被研究。有趣的是，在最近的研究中，本課題組在動脈粥樣硬化的股動脈組織中觀察到了Pin1表達水平的下調，同時伴有VSMCs衰老程度的增加。因此，本研究試圖確定Pin1在人體動脈粥樣硬化的VSMCs衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1材料動脈粥樣硬化的股動脈標本來自于6例2012年5月至2013年7月在上海仁濟醫院接受股腘動脈人工血管轉流術的嚴重動脈粥樣硬化患者（年齡53～83歲，平均年齡64歲）。正常股動脈標本來自5位捐獻者（年齡42～78歲，平均年齡63歲），均在2012年5月至2014年6月期間因下肢嚴重創傷在上海仁濟醫院接受截肢手術。所有參與者皆簽署了知情同意書。血管平滑肌細胞（VSMCs）由本實驗室對股動脈組織進行原代培養所得［11］。上海仁濟醫院倫理委員會通過了此實驗方案。

1.2試劑抗Pin1抗體、抗視網膜母細胞抗體（anti-pRb）、抗磷酸化視網膜母細胞抗體（anti-ppRb）、以及抗β-肌動蛋白抗體（英國Abcam公司），抗周期蛋白B抗體、抗周期蛋白E抗體（美國BD Pharmingen公司），抗周期蛋白D抗體（美國Santa Cruz公司），TeloTAGGGTelomerase PCR ELISA試劑盒（德國Roche Applied Science公司），表達Pin1的腺病毒（Ad-Pin1）及對照的腺病毒（Ad-LacZ）（上海吉凱基因化學技術有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養從血管上輕柔地分離掉外膜和內膜細胞，將VSMCs用組織貼片法培養于DMEM完全培養基（內含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，置于37℃、5.0%CO2的培養箱中。VSMCs由平滑肌細胞a-肌動蛋白免疫染色驗證。在所有實驗之前，細胞在DMEM培養基中經過24 h的血清饑餓處理。

1.3.2運用免疫組化技術檢測人體動脈粥樣硬化病變的股動脈組織中Pin1的表達將股動脈組織在多聚甲醛中貯存24 h，隨后放入乙醇中貯藏直到石蠟包埋。免疫組化技術的應用如前所述［13］。非特異性染色檢測相應IgG的陰性對照組。

1.3.3利用改良的TRAP法分別檢測正常及動脈粥樣硬化的股動脈組織中VSMCs的衰老情況運用光度酶免疫分析法結合端粒擴增法來檢測細胞端粒酶活性。分離的細胞當量為1×103，均通過TeloTAGGGTelomerase PCR ELISA試劑盒來檢測端粒酶活性，詳細步驟見說明書。

1.3.4運用蛋白質印跡分析法檢測VSMCs和過表達Pin1的人體動脈粥樣硬化的VSMCs中pRb通路以及cyclin通路關鍵蛋白的表達如前所述，VSMCs分為對照組（Ad-LacZ）和過表達Pin1組（Ad-Pin1），在無血清的DMEM培養基中進行6 h的腺病毒轉導［14］。蛋白質印跡實驗根據前述的標準方案來實施［11］。β-肌動蛋白作為內參。

1.4統計學方法計量資料以形式表示。運用D′Agostino和Pearson多項性檢驗對正態分布進行了檢驗。如果值呈正態分布，那么對兩組間差異進行Student′st檢驗求得未配對均值，兩組以上的差值進行方差分析后進行Bonferroni′s多重比較分析檢驗。如果結果不服從正態分布，那么差異將分別由Mann-Whitney或Kruskall-Wallis檢驗以及Dunn′s事后分析來進行比較。以P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1人體動脈粥樣硬化病變的股動脈組織中Pin1表達下調與對照組血管（正常股動脈）相比，人動脈粥樣硬化股動脈組織（n=10）中Pin1蛋白表達水平（圖1，×100倍）明顯下調（P＜0.05），組間的患者數據沒有差別，這些數據包括年齡、性別、高血壓或糖尿病患者比例、吸煙患者比例以及最近三個月內服用他汀類藥物患者比例。

2.2動脈粥樣硬化的VSMCs衰老增加與正常VSMCs相比，動脈粥樣硬化的VSMCs端粒酶活性被抑制（P＜0.05）（圖2）。

2.3Pin1抑制VSMCs衰老和pRb磷酸化與正常VSMCs相比，動脈粥樣硬化的VSMCs中p-pRb的表達水平顯著增加（P＜0.05）；與對照組（Ad-LacZ）相比，過表達Pin1組（Ad-Pin1）人動脈粥樣硬化的VSMCs中p-pRb的表達水平顯著下降（P＜0.05），這提示Pin1通過抑制pRb磷酸化來防止VSMCs衰老。

圖1 免疫組化檢測人正常和動脈粥樣硬化的股動脈組織中Pin1的表達Fig.1 Detection of Pin1 level in normal and atherosclerotic femoral artery by immunohistochemistry

圖2 改良的TRAP法檢測體外Pin1對VSMCs衰老的影響Fig.2 Detecting the effect of Pin1 on the senescence of VSMCs in vitro using a modified TRAP assay

2.4Pin1調節VSMCs衰老以及改變不同細胞周期蛋白的表達與正常VSMCs相比，動脈粥樣硬化的VSMCs中細胞周期蛋白B、D和E表達水平明顯下調（P＜0.05）；與對照組（Ad-LacZ）相比，過表達Pin1組（Ad-Pin1）人動脈粥樣硬化的VSMCs中細胞周期蛋白B、D和E表達水平顯著增加（P＜0.05）。

圖4 蛋白質印跡分析法檢測VSMCs中細胞周期蛋白B、D和E的表達Fig.4 Detection of Cyclin B，D and E levels in VSMCs by Western blot

3 討論

根據目前的研究，Pin1表達水平的下調很可能是促進VSMCs衰老及動脈粥樣硬化的一個因素。本研究闡述了人體動脈粥樣硬化VSMCs中Pin1表達的下調及其與VSMCs衰老的關系。本課題組實驗數據顯示，相比于正常情況，動脈粥樣硬化的股動脈組織中Pin1蛋白表達水平明顯下調，同時動脈粥樣硬化的VSMCs端粒酶活性被抑制。為了進一步探究Pin1抑制VSMCs衰老的機制，本研究檢測了VSMCs中一些重要的衰老調節因子。結果表明，動脈粥樣硬化的VSMCs中，p-pRb的蛋白水平明顯增加。相反，在動脈粥樣硬化的VSMCs中過表達Pin1導致p-pRb的蛋白水平顯著下降，同時VSMCs衰老程度降低。筆者還發現，相比正常VSMCs，動脈粥樣硬化的VSMCs中細胞周期蛋白B、D和E表達明顯下調，反之當Pin1過表達時，細胞周期蛋白B、D和E上調，表明Pin1可能通過調控cyclin通路參與調節VSMCs的衰老。然而，在VSMCs中細胞周期蛋白B、D和E的表達具體如何被Pin1調控仍然有待進一步研究。本研究表明，Pin1可能通過影響p-pRb通路以及cyclin通路來調控VSMCs衰老，為研究Pin1和動脈粥樣硬化之間的潛在機制提供了新的視角。

Pin1在細胞衰老的過程中發揮重要作用。TOKO等［15］證實，缺失Pin1會導致細胞周期停止，促進細胞衰老，同時Pin1過表達能促進心祖細胞分化并抑制其衰老。WHEATON等［16］報道，晚期人成纖維細胞中Pin1表達水平受抑制，促進細胞衰老，而Pin1異常高表達阻止了BTG2介導的細胞衰老。但是，Pin1在VSMCs衰老中的作用還沒有被證實。動脈粥樣硬化股動脈組織中Pin1表達水平的上調支持筆者關于Pin1促進VSMCs衰老的假設。

為了探求Pin1抑制VSMCs衰老的機制，本課題組檢測了Pin1對一些介導細胞衰老的關鍵因子的影響。研究表明，pRb是Pin1作用的靶點［17］。Pin1通過改變pRb的親和力而改變了周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的活性。pRb在G0到G1/S的過渡階段逐漸被CDKs磷酸化。基于CDKs增強Pin1-pRb聯系的證據，Pin1對于pRb通過CDKs進行磷酸化的完整過程是必需的［18］。CDKs和細胞周期蛋白在磷酸化過程中是主要參與者，而Pin1是協調這一過程的關鍵蛋白［17］。本課題組研究發現，在動脈粥樣硬化的VSMCs中伴隨著Pin1表達的下調，pRb磷酸化水平均增高，細胞周期蛋白B、D和E的表達水平下降。在動脈粥樣硬化的VSMCs中，過表達Pin1可抑制pRb磷酸化，細胞周期蛋白B、D和E的表達水平上升。所有的結果表明，Pin1通過活化pRb通路和cyclin通路來調節VSMCs衰老，并且在動脈粥樣硬化的發生發展中扮演重要角色。當然，調控VSMCs衰老的信號級聯反應的具體作用機制將是一個值得進一步探索的新研究方向。

綜上所述，VSMCs的衰老或許對動脈粥樣硬化的形成與發展有重要影響。因此，清晰地闡明VSMCs的衰老在動脈粥樣硬化中的具體作用機制很重要。當前研究結果表明，Pin1是VSMCs衰老調節機制中的關鍵因子，不僅拓寬了我們對于Pin1促進VSMCs衰老的認識，也為探索其具體分子機制提供了新的視角。因此，以Pin1為靶點的干預治療或許是緩解與VSMCs衰老有緊密關聯的動脈粥樣硬化的新途徑。