血清外泌體miRNA-193b診斷阿爾茨海默病的價值

劉辰庚 楊婷婷 王培昌

首都醫科大學宣武醫院檢驗科（北京100053）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是老年人中最常見的進行性神經退行性疾病。其病理改變主要表現為腦內細胞外β淀粉樣蛋白（Aβ）和細胞內磷酸化tau蛋白的大量沉積。輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）被認為是AD發病的前驅階段，主要表現為記憶力、注意力、語言和視空間等認知功能不同程度的輕度下降。主觀認知障礙（subjective cognitive decline，SCD）被認為是AD的臨床前期階段，表現為患者主訴記憶力下降，而認知評估卻表現為正常水平。癡呆期（dementia of Alzheimer′s type，DAT）是阿爾茨海默病晚期階段，表現為智力嚴重衰退，嚴重影響患者日常生活能力，對家庭和社會造成沉重的負擔［1］。因此，探索AD發病前期階段（前驅期和臨床前期）大腦生物標志物改變將有助于對其進行早期干預、早期治療，從而延緩病情的進展［2］。

本實驗室前期細胞實驗的結果表明miR-193b能通過與APP mRNA的3′-UTR結合使其降解從而抑制APP的蛋白表達，同時Aβ42能降低miR-193b的表達［3］。之后提取MCI和DAT患者CSF和血清的外泌體并檢測其中miR-193b的含量，發現外泌體內miR-193b在MCI患者的血清中較對照組顯著降低，且DAT患者血清外泌體內miR-193b低于MCI患者。血清外泌體miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標志物［4］。但是目前本課題組進行的MCI和DAT患者血清外泌體miR-193b檢測尚屬小樣本研究，而且沒有納入SCD患者，因此本研究旨在通過大樣本檢測SCD、MCI、DAT患者血清外泌體miR193b的表達水平，進一步探索血清外泌體miR193b作為AD的早期診斷標志物的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料隨機選取2015年9月至2016年8月就診于首都醫科大學宣武醫院SCD患者30例，其中男11例，女19例，平均年齡（61.66±5.43）歲。MCI患者69例，其中男30例，女39例，平均年齡（66.14±7.61）歲。DAT患者73例，其中男30例，女43例，平均年齡（74.12±8.19）歲。SCD患者診斷符合pre-MCI之主觀認知障礙研究標準［5］。MCI和DAT疾病診斷符合美國國立衛生研究院國立老化研究所和阿爾茨海默病協會于2011年4月聯合發布，并經我國神經內科學會推薦的診斷標準［6］。另選同期性別和年齡基本一致的非癡呆對照人群75例（健康對照組），其中男36例，女39例，平均年齡（67.34±6.56）歲，該組人群基本健康，無腦梗死、腦出血、冠心病、腦外傷等病史；受試者或其家屬均簽署書面知情同意書，并經本院倫理委員會批準立項。

1.2主要儀器及試劑日立HT7700透射電子顯微鏡（日本日立高新技術公司）羅氏480定量PCR系統（德國Roche公司）；化學發光成像系統（美國ProteinSimple公司）；Total exosome isolation reagent（from serum）試劑盒（Invitrogen）；血清miRNA提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）；miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）；miRNA熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green Ι染料法）（上海生工生物有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；抗Alix、CD63單克隆抗體（美國SBI公司）。

1.3方法

1.3.1標本采集受試者于空腹12 h后用促凝管采集外周靜脈血5～10 mL，勿顛倒混勻；室溫靜置30 min后，4℃、4 000 r/min離心10 min，取上層淡黃色血清，于冰上分裝成500 μL于1.5 mL EP管后置于-80℃冰箱備用。以上過程保證在2～3 h完成。

1.3.2血清外泌體的提取按照invitrogen公司total exosome isolation（from serum）外泌體提取試劑盒說明書進行。

1.3.3透射電鏡鑒定血清外泌體形態取15～20 μL外泌體樣品懸液滴于帕拉膠上，并覆蓋銅網，室溫靜置5 min。用濾紙從側面吸去多余的液體，滴加20 g/L的磷鎢酸，室溫復染5 min。在65℃白熾燈下烤15 min。透射電鏡下觀察、拍照。

1.3.4Westrn blot檢測外泌體標記蛋白將提取的外泌體總蛋白及血細胞蛋白經BCA試劑盒進行蛋白定量，12%SDS-PAGE膠電泳分離，轉印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，漂洗5 min，加入按1∶1 000比例稀釋的兔抗人CD63、Alix單克隆抗體，室溫孵育1.5 h后4℃過夜。二抗室溫避光孵育120 min，均勻滴上ECL超敏化學發光液，進行曝光拍照。

1.3.5血清外泌體內miR-193b的提取及測定PCR反應檢測血清中miR-193b水平：測量以試劑盒法提取外泌體總miRNA，測定濃度后進行逆轉錄反應，20 μL逆轉錄反應體系中含2×miRNA RT Solution mix 10 μ L，miRNA RT Enzyme mix 2 μL，micro RNA100 ng。20 μL PCR反應體系中含2×miRNA qPCR master mix10 μL，Template DNA 2 μL，相應上、下游引物各 0.5 μL。反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40個循環。引物序列見表1，以U6 sn RNA為內參，使用2-ΔΔCt法［7］計算并統計miR-193b組間表達的差異。

表1 PCR上游引物序列Tab.1 The sequence of PCR forward primers

1.4統計學方法采用2-△△Ct法計算miR-193b的相對表達量，使用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，用MedCalc software、GraphPad Prism軟件進行作圖。應用K-S檢驗對數據進行正態性檢驗；計量資料以均數±標準差（）表示；不同組之間miRNA的表達差異采用Mann-Whitney非參數檢驗法進行統計分析采用分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。通過利用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及曲線下面積（the area under the ROC curve，AUC）來評價miR-193b對AD的早期診斷價值，曲線下面積的比較采用Z檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血清中外泌體的分離鑒定首先，應用納米粒子跟蹤分析（NTA）觀察外泌體樣品粒徑分布及顆粒濃度。如圖1A所示，顆粒直徑呈單峰正態分布曲線，顆粒主要分布于30～200 nm之間。樣品中顆粒分散均一。透射電鏡鑒定外泌體形態，電鏡內可見直徑約為100 nm，圓形具有脂質雙層膜囊狀的顆粒見圖1B。蛋白免疫印跡（Western blot）檢測外泌體標志性蛋白分子的表達情況，表明提取的外泌體均表達Alix，CD63標志性蛋白分子見圖1C；以上結果表明，樣品具有已報道的外泌體的特性。純化的樣品中含有大量外泌體顆粒。

2.2各組血清外泌體miR-193b表達水平變化

健康對照組、SCD、MCI及DAT患者4組血清外泌體miR-193b的表達水平如圖2A所示。4組間兩兩比較差異均具有統計學意義（P＜0.05）；SCD、MCI和DAT患者血清外泌體內miR-193b水平均低于對照組，且DAT組低于MCI組，MCI組低于SCD組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3血清外泌體miR-193b對SCD的診斷價值檢測血清外泌體miR-193b用于診斷SCD時，AUC為0.947（95%CI：0.886 ～ 0.981），具有一定診斷價值。其診斷臨界值為1.83時，特異度為94.7%，靈敏度為83.3%。見圖2B。

圖1 外泌體的分離鑒定結果Fig.1 Isolation and identification results of exosomes

圖2 血清外泌體miR-193b在阿爾茨海默病患者中的檢測分析Fig.2 Detection and analysis of serum exosome miR-193b in patients with Alzheimer′s disease

3 討論

近年來利用各種生物標志物來探測腦內AD相關的病理及特征性改變，使得AD的診斷階段不斷提前，2014年主觀認知下降概念啟動組（subjective cognitive decline initiative，SCD-Ⅰ）提出的AD臨床前期的SCD概念框架，特別提出伴有ApoE ε4等位基因、AD病理相關的生物標志物陽性等條件可以增加其作為AD臨床前期的特異性［5］。因此，繼續深入研究AD相關診斷標志物，有助于臨床診斷極早期AD，為AD的早期干預及治療提供更寬的時間窗。

研究發現miR在細胞內具有多種重要的調節作用。HEBERT等［8］發現，在早期AD患者皮質中miR-107的表達顯著下降，進一步實驗表明，在AD的發展過程中，當miR-107表達降低時，BACE1蛋白水平增加，所以HEBERT等［8］推論miR-107可能通過調節BACE1基因的表達從而加速AD的進展。KHOO等［9］對AD患者及對照的大腦皮質區進行miRNA分析，檢測到13種miRNA在AD腦內的表達顯著降低，數據分析后發現7種miRNA的靶基因可能參與了AD病程，如miR-9、miR-15a、miR-19b和miR-29b-l均在BACE1基因的3′UTR 存在相應的結合位點；而 let-7、miR-15a、miR-101和miR-106b在APP基因的3′UTR存在結合位點。雖然大多數miRNA在細胞內發現，但越來越多的證據表明miRNA也存在于細胞外的體液中，如血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液等［10-12］，特別是外周血miR對疾病的診斷和治療監測具有較大的潛在價值。MiRNA在細胞外的存在形式主要有3種：包裹于外泌體等膜囊泡中、與高密度脂蛋白結合以及與AGO2蛋白結合，這三種形式可避免細胞外miRNA被內源性核糖核酸酶降解，保證其穩定性［13-15］。而外泌體miRNA被認為是在分泌細胞的支配下主動轉運特定的miR，雖來源于細胞，卻與來源細胞存在差異，并且其表達水平可隨生理條件的不同而改變，更能真實體現疾病的狀態，近年來頗受關注，逐漸成為了研究熱點。

本研究選擇了血清外泌體作為miRNA的來源，納入就診于本院的認知障礙患者212例。通過Western blot檢測發現，外泌體中穩定表達CD 63和Alix標志性蛋白分子，并通過電鏡觀察證實了提取物為血清來源的外泌體，與文獻報道的類似。以純化的外泌體提取總RNA，通過qRT-PCR分別檢測認知障礙患者和健康體檢人外泌體miR-193b水平，結果顯示，SCD、MCI和DAT患者血清外泌體內miR-193b水平均低于健康對照組，且DAT組低于MCI組，MCI組低于SCD組，差異有統計學意義（P＜0.05）。診斷試驗提示血清外泌體miR-193b對SCD具有一定的診斷價值。此結果表明血清外泌體miR-193b可能成為AD早期診斷的有效檢測手段，具有一定的推廣應用前景。但本研究為單中心的臨床研究，其結果尚需大規模、多中心的臨床研究證實，從而進一步探索血清外泌體miR-193b作為AD早期診斷標志物的意義。