PCR-DGGE技術在城鎮供排水系統微生物多樣性研究中的應用

賈淑宇，張克峰，逯南南，王明泉，趙清華,孫韶華，賈瑞寶

(1.山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南 250101；2.山東省城市供排水水質監測中心，山東 濟南 250013)

目前微生物多樣性是微生物生態學的主要研究內容之一，通過研究微生物多樣性從而將微觀的微生物群落結構與宏觀的生態系統功能之間緊密相連。在自然環境中，僅有0.1% ～1%的微生物可以通過常規培養方法進行檢測與分離[1]，大量的微生物以活的非可培養狀態的形式存在，如霍亂弧菌、產毒素大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎桿菌、宋內志賀氏菌、創傷弧菌、副溶血性弧菌等[2]，這些非可培養狀態的微生物對人類健康構成了潛在的威脅。

應用分子生物學技術是目前微生物研究的一種趨勢，隨著分子生物學技術的發展，越來越多的技術廣泛運用于微生物的鑒定中，其中變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技術是檢測微生物多樣性的技術手段之一。Fischer等[3]最早利用DGGE技術檢測DNA片段中的點突變；Muyzer等[4]第一次利用DGGE技術分析了復雜微生物種群遺傳的多樣性，之后該技術被廣泛應用于研究水體、土壤[5]、活性污泥、沉積物[6-7]等環境樣品中微生物群落結構的多樣性及其動態變化，包括細菌、真菌、藻類和真核原生生物群落[8-10]等；近幾年DGGE技術也常用于研究微生物能源的開發[11]。

基于上述研究，本文概述了聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(Ploymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)技術的原理和特點，通過對水體微生物相關研究成果的系統分析，總結并歸納了PCR-DGGE技術在城鎮供水系統和污水處理系統中微生物多樣性分析等方面的研究進展和應用成效，為該技術在水環境中微生物多樣性的研究提供理論依據。

1 PCR-DGGE技術的原理和特點

1.1 PCR-DGGE技術的原理

普通凝膠電泳無法分開長度相同但序列不同的DNA片段，變性梯度凝膠電泳(DGGE)是在聚丙烯酰胺凝膠中加入線性梯度的尿素和甲酰胺作為變性劑，以區分長度相等但序列不同的DNA分子。電泳時隨著變性劑濃度的升高， DNA雙鏈序列遷移到變性凝膠一定位置并達到其解鏈溫度時便開始部分解鏈，DNA雙鏈末端一旦開始解鏈，其在凝膠中的電泳速度將大幅度下降。長度相同但序列不同的DNA片段的解鏈區域及解鏈溫度都不同，它們在凝膠中不同位置發生部分解鏈而導致遷移速率大大下降，泳動受阻的DNA片段在不同位置停留，從而達到分離不同序列DNA片段的目的。

序列不同的DNA片段最終以電泳圖像展現出來，采用Quantity One 分析軟件通過對電泳條帶進行定量分析，分析結果可作為微生物多樣性統計的基礎數據。通常以Shannon-Weiner(H)指數來反映群落中微生物的種類，群落中微生物的種類增多代表群落的復雜程度增加，即H值愈大，表明群落中所含微生物的種類越多；以Pielou’s均勻度指數(E)估計該群落物種分布的均勻度[12]。具體計算公式如下：

(1)

E=H/lnS

(2)

式中:pi表示第i個種群的相對多度,pi=ni/N(其中ni為第i個種群的個體數；N為群落中所有種群的個體總數)；S表示物種的豐度，即樣本中含有的物種總數。

PCR-DGGE技術的操作過程復雜(見圖1)，每個環節皆有可能影響研究結果，眾多研究者在減少干擾、提高方法準確度等方面做了大量的工作。如吳敏娜等[13]研究發現采用異硫氰酸胍(Guandine Thiocyanate,GITC)法提取DNA可獲得較高的濃度和純度，是一種較為理想的DNA提取方法。在進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增時，由于靶基因擴增幾率不同，會造成擴增偏差，Korbie等[14]證明采用降落PCR技術可提高PCR擴增的特異性和靈敏度，使用多種引物同時分析亦可減少擴增偏差。DGGE技術通常使用溴化乙啶(Ethidium Bromide,EB)作凝膠染色劑，其操作簡單，但它是一種具有高誘變性的化學物質，且靈敏度較低，染色后背景熒光信號較高；Gel Red和Gel Green 是近年來新興的兩種安全穩定的熒光核酸凝膠染色劑，無論是用于預制凝膠染色還是凝膠電泳后染色，都具有極高的靈敏度。

圖1 PCR-DGGE技術的基本操作流程Fig.1 Flow chart of the basic operation of PCR- DGGE technology

1.2 PCR-DGGE技術的特點

基于研究的技術類型，一般將微生物多樣性研究方法分為兩大類：傳統生物化學方法和現代分子生物學技術。傳統生物化學方法包括異養菌平板計數法(Heterotrophic Plate Counts,HPC)、光學顯微鏡分析、Biolog微平板分析、磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)譜圖分析、脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Esters，FAME)譜圖分析等，這些方法適用范圍與精度各不相同，各有其優缺點：非可培養微生物影響HPC結果的準確性；部分細胞形態學差異不明顯，很難在光學顯微鏡下區分，且缺乏細胞壁的微生物固定后很容易變形，更難在顯微鏡下進行分類鑒定；Biolog微平板分析能夠進行95種唯一碳源的生化反應測試，靈敏度高，但精度一般；PLFA和FAME譜圖分析可以定量描述微生物群落的動態變化，但針對特異微生物類群的鑒定還不夠準確。現代分子生物學技術從基因層面研究微生物的多樣性，如核酸探針、生物芯片、雙向電泳、熒光定量PCR技術等，這些技術可以對某一特定微生物種類進行定性鑒定，甚至還可做定量分析，但它們不能對環境中共存的其他微生物進行鑒定。

PCR-DGGE技術有效解決了上述問題，能夠快速、全面、準確地獲得樣品中微生物的信息，較傳統生物化學方法具有明顯的優勢，被越來越多的微生物研究學者所推崇，但該技術也存在一些弊端，其優缺點詳見表1。

表1 PCR-DGGE技術的優缺點

從最初用于檢測點突變到分析微生物多樣性及其動態變化，PCR-DGGE技術不斷得到改進，已衍生出溫度梯度凝膠電泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE)、瞬時溫度梯度電泳(Transient Temperature Gradient Electrophoresis,TTGE)和恒定變性凝膠電泳(Constant Denatured Gel Electrophoresis,CDGE)等技術，使其操作方法不斷優化且結果準確性有所提高，而在DGGE技術基礎上發展的雙梯度DGGE(Double-Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DG-DGGE)[15-16]技術、依賴培養的DGGE(Culture-Dependent Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,CD-DGGE)[17]技術等，使DNA片段條帶展現得更加清晰、全面，同時DGGE技術結合熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)[18]技術、微電極測量技術[19]等方法進行綜合分析，克服了PCR-DGGE技術的弊端，可為更詳細、準確地分析微生物群落的復雜性服務，這些都將使PCR-DGGE技術在分子生物學研究中發揮著愈來愈重要的作用。

2 PCR-DGGE技術的應用

隨著PCR-DGGE技術體系的日益成熟，已被越來越多地應用于水環境中微生物多樣性的檢測，尤其在城鎮供水系統和污水處理系統中微生物多樣性檢測方面的大量應用，將有助于了解其微生物群落結構，對保護生態環境及人類健康具有重大的意義。

2.1 PCR-DGGE技術在城鎮供水系統中的應用

眾多學者利用PCR-DGGE技術對城鎮供水系統中微生物多樣性和群落結構進行了鑒定(見表2)，以表征城鎮供水系統中微生物群落結構的穩定性，為水源水質穩定性監控、水廠消毒處理工藝運行以及管網水質安全保障提供微生物學的基礎信息。

表2 PCR-DGGE技術在城鎮供水系統中的應用

2.1.1 水源生態系統

(3) 若Uα,取V=[α],則對任意的(x,z)V°V,存在L,使得(x,y)V, (y,z)V。由[α]的定義知(x→y)?(y→z)≥α,同時(y→z)?(z→y)≥α。

PCR-DGGE技術可用于藻類水華防治，Ye等[20]利用DGGE技術和實時PCR技術，分析了太湖水體和沉積物樣品中藍藻種群的時空分布及其與水華形成的相關性，研究發現微囊藻和聚球藻為優勢藍細菌，且水華產生和消退與水環境中細菌群落密切相關；Wang等[21]從塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)培養物中提取細菌DNA擴增16S rRNA基因片段，并進行DGGE分析測序，結果發現在藻類裂解過程中“藻際”細菌群落(由于藻向環境釋放大量有機物質，使藻細胞周圍形成一種獨特的、可稱為“藻際”的微環境，這種環境中聚集著大量細菌，形成具有獨特結構與功能的“藻際”細菌群落)結構發生了明顯變化，Alteromonassp.和Thalassobiusaestuariisp.是引起藻類裂解的關鍵因素，“藻際”細菌產生的β-葡萄糖苷酶和幾丁質酶能直接導致藻類裂解；Yang等[22]通過對中國廈門海域Akashiwosanguinea赤潮與其細菌群落的動態關系研究，首次證明了細菌群落特別是丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)在調控赤潮中具有重要的作用，Sediminimonasqiaohouensis細菌與Akashiwosanguinea赤潮呈負相關，這種細菌可能是赤潮的重要負調控因子之一。

PCR-DGGE技術也可用于水源生態系統中真菌群落結構的研究。真菌種類豐富、代謝能力強、生命活動過程復雜，在水源生態系統物質循環中起著重要的作用，水生真菌種類組成及其季節演替是它們在水源生態系統中作用的關鍵。然而普通引物很難適用于水生真菌群落結構的檢測與鑒定，特別是壺菌門和隱真菌門。Ishii等[23]研究發現水生真菌DGGE分析中ff390w/ef3r引物對特異性最高，適合水生真菌群落結構的檢測,而f390w/ef3r GC引物對可用于分析檢測水生真菌群落結構的演替，這對研究水生真菌群落結構及其季節演替具有重要的意義。

2.1.2 給水處理系統

水處理工藝不同階段微生物群落結構具有明顯的差異性，對飲用水處理過程中微生物群落結構的動態解析可為優化工藝參數提供依據。如張錫輝等[24]利用PCR-DGGE技術對深圳市某水庫原水、飲用水處理廠進水及出水微生物群落結構特征進行了研究，結果發現3個細菌類群影響水質,即原水中存在腸道致病菌氣單胞菌屬影響水源微生物安全性，生絲微菌和光合細菌紅假單胞菌均具有凈化水質的能力；Tian等[25]在以臭氧/活性炭為主的飲用水處理系統中發現了7種優勢菌群，且不同處理階段優勢菌群有所差異，其中擬桿菌和γ-變形桿菌的含量經臭氧和活性炭過濾處理后急劇下降，厚壁菌經臭氧和活性炭處理后逐漸成為優勢菌；Ma等[26]采用PCR-DGGE技術對兩個不同飲用水處理廠污泥中細菌群落結構進行了初步研究，結果發現污泥微生物群落結構復雜，多種類型微生物大量存在其中，DGGE條帶相似性分析得出27條優勢條帶中包含9種門類，為自來水廠污泥無害化處理提供了有效信息。

2.1.3 管網輸配系統

管網輸配系統中不同管材內壁提供了不同的生長環境，所附著的管網生物膜微生物群落結構也有所差異，而不同消毒劑的組成和濃度也會影響管網內微生物的群落結構。當管網生物膜因新陳代謝或水力條件改變[27]發生脫落時會影響水體的色度和氣味，甚至會對人體健康造成威脅。Rozej等[28]將自來水引入非增塑聚氯乙烯(PVC)、硅烷交聯聚乙烯(PEX)和高密度聚乙烯(HDPE)3種不同材料的塑料管道，在系統運行2年后通過掃描電子顯微鏡、HPC技術、DGGE技術分析管網生物膜微生物的群落結構，結果發現：塑料管網生物膜形成能力因使用材料不同而有所差異，且管網生物膜形成的敏感性表現為HDPE >PEX> PVC；生物膜在管內表面結構和微生物群落結構方面存在差異性；雖然微生物多樣性和豐富度受管材影響，但微生物數量與管材無關。 Roeder等[29]通過DGGE技術比較了不同消毒劑對管網生物膜微生物群落結構的影響，結果發現消毒方法引起的管網生物膜微生物種群選擇壓力取決于消毒劑的組成和濃度，消毒劑對飲用水管網生物膜微生物群落結構產生極大的影響。因此，在評價飲用水設施消毒方法的有效性時，不僅要考慮某些細菌的減少，而且要注意管網生物膜微生物群落結構的變化。

2.2 PCR-DGGE技術在污水處理系統中的應用

活性污泥法和生物膜法是較為常用的污水生物處理方式，通過PCR-DGGE技術了解污水處理過程中微生物群落結構及其動態變化(見表3)，可為污水處理條件的優化、污水處理效率的提高以及廢水中微生物資源的利用與開發提供理論依據。

2.2.1 活性污泥法

PCR-DGGE技術可用于比較微生物群落結構的差異以及監測和控制污水處理過程中微生物群落結構的動態變化。 Aell等[30]通過對A2/O和倒置A2/O兩種處理系統的活性污泥進行研究，結果發現Microthrixparvicella和NostocoidalimicolaI是導致污泥膨脹的主要原因，這兩種處理系統中微生物群落結構的相似性較高，但兩種系統在相同周期內經歷了不同微生物群落結構的變化，因此處理效果存在一定的差異性；Boon等[31]通過分析4種不同類型污水的活性污泥菌群多樣性，結果發現污水種類是影響活性污泥群落結構的重要因素；Liu等[32]對處理中藥工業污水的厭氧折流反應器(PABR)中4個不同隔斷微生物群落結構進行了研究， DGGE分析顯示：在正常負荷下和有機負荷(OLR)穩定階段，每個隔斷微生物群落結構趨于相似；在OLR增高階段，不同隔斷同一取樣時間微生物樣本的群落結構并不相同，且同一隔斷不同取樣時間微生物樣本的群落結構也不相同；在OLR超負荷運轉階段，出水水質迅速惡化，微生物群落結構變化顯著。

表3 PCR-DGGE技術在污水處理系統中的應用

2.2.2 生物膜法

國內外一些學者利用PCR-DGGE技術體系對膜生物反應器(Membrane Bio-Reactor,MBR)和序批式生物膜反應器(Sequencing Biofilm Batch Reactor,SBBR)這兩種膜分離技術與生物處理技術有機結合的新型廢水處理工藝中生物膜的微生物群落結構進行了研究。如牟潔等[33]利用PCR-DGGE技術研究發現MBR中具有獨特的微生物群落結構，其中氣單胞菌屬、假單胞菌、亞硝酸菌屬、從毛單胞菌屬和桿菌等優勢菌群在該反應器去除有機物的過程中起到了關鍵作用;Liu等[34]研究了MBR與蚯蚓反應器聯合處理綜合污水中微生物群落結構及多樣性的變化，結果發現聯合反應器(S-MBR)中微生物群落結構比傳統MBR(C-MBR)更多樣化，一些富集在S-MBR中生長緩慢的微生物如腐敗螺旋菌、放線菌、固氮菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌等，有利于提高COD去除率、減少污泥量及減緩膜污染；Xin等[35]通過DGGE技術、FISH技術和16S rRNA擴增子焦磷酸測序法研究了SBBR中含氮廢水的同步硝化、厭氧氨氧化和反硝化工藝在不同底物濃度下微生物群落結構的變化，結果發現當氨氮濃度從2 200 mg/L下降到50 mg/L時，氨氧化菌的相對含量下降，而厭氧氨氧化細菌相對含量無明顯變化，且在反硝化系統中Nitrosomonaseuropaea為氨氧化菌的優勢菌屬，厭氧氨氧化菌的優勢菌屬是CandidatusBrocadia;Li等[36]研究了SBBR中林可霉素污水共代謝降解及微生物群落的多樣性，DGGE和16S rDNA結果顯示共代謝系統中微生物種群多樣性較對照組更為豐富，Roseovarius(3.35%)、Thiothrix(2.74%)、Halomonas(2.49%)、Ignavibacterium(2.02%)和Tm7_genus_incertae_sedis(1.93%)為優勢菌屬，共代謝是不同優勢菌屬的協同作用，這對林可霉素及其類似物的生物修復具有重要的啟示。

2.2.3 自然生物處理法

PCR-DGGE技術可用于自然生物處理系統中微生物群落多樣性的檢測，能夠有效指導調控該系統參數，達到高效凈水的目的，目前其在自然生物處理系統的穩定塘和濕地系統中的應用最為廣泛。PCR-DGGE技術可研究濕地系統中的微生物數量、豐度及多樣性，并分離鑒別濕地系統中具有特定功能的微生物群落[37]，對研究濕地系統的微生物群落結構及分布、污染物降解機制等方面具有重要的意義。如Adrados等[38]利用端點PCR和DGGE技術分析了丹麥3個不同生活污水處理系統(水平流人工濕地、垂直流人工濕地和生物濾池)中細菌和古細菌的群落結構，結果發現微生物群落結構與處理系統設計和有機物負荷有關，而微生物群落與污水進水之間無明確關系；郭冀峰等[39]利用PCR-DGGE技術分析了南北兩地區農村穩定塘底泥系統中微生物的群落結構及多樣性，結果發現南北方兩地區農村穩定塘底泥系統中微生物的群落結構及多樣性基本相似，無明顯區別。大部分受污染環境的修復是在人工協助下進行的自然生物凈化，Hassanshahian等[40]利用PCR- DGGE技術分析了海洋石油污染過程中微生物群落結構的變化，結果發現原油污染會降低海洋微生物群落的多樣性；在海洋環境修復過程中，不同種類細菌之間的相互作用會抑制海洋環境的生物修復，使用單一細菌降解海洋石油污染比使用細菌共同體更具有優勢。

目前污水無害化處理主要依賴細菌的作用，因為真菌很難與生物反應器中其他微生物競爭。如Badia-Fabregat等[41]研究了污水中細菌和真菌群落對真菌處理性能的影響，結果發現許多土著真菌會與接種真菌競爭影響污水處理的效果。因此，如何解決接種真菌在生物競爭中的劣勢問題，還有待進一步探究以期獲得良好的污水處理效果。

3 結論與展望

PCR-DGGE技術以其檢測限低、快速、準確、全面等優點被廣泛應用于微生物分子生態學研究領域，同時該技術自身也在不斷完善，正與越來越多的新興技術方法融合發展，并在城鎮供排水系統中微生物群落結構及多樣性研究方面得到了廣泛應用：①分離鑒定城鎮供水系統中優勢菌群，有效防治水華及調控赤潮，監測控制水處理過程中藻類與致病微生物的暴發，為提高供水系統生物穩定性提供技術支撐；②分析研究城鎮污水處理系統中微生物礦化污染物的原理及作用過程，為提高污染物處理效率、優化污染物處理工藝及修復受污染環境提供理論指導。

PCR-DGGE技術作為分子生物學研究的技術手段已經較為成熟，結合城鎮供排水系統微生物多樣性的研究現狀與發展趨勢，未來仍需從以下幾方面繼續開展系統、深入的研究：①針對PCR-DGGE技術應用過程中存在的共遷移和異質性等問題，改進技術方法或結合新興技術降低這些問題對研究結果的影響，以提高基因片段分離率與結果準確性；②系統探索細菌、真菌和藻類等其他類型水生微生物群落結構的研究方法，進一步完善技術應用方法學體系，以拓寬技術應用領域和范圍；③深入探討微生物群落結構對水環境的作用機理及其影響因素，提高城鎮供水系統的生物穩定性和城鎮污水處理系統的處理效率，并探明微生物群落與其他類型群落之間的相互作用，進一步評價生態系統功能，為水環境生態系統的修復與保護提供有力的科學依據。