不同病程CIA大鼠血清及關節局部TNF-α水平表達的研究

王艷艷 孫曉萱 張繆佳 王嬙（通訊作者）

（南京醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科 江蘇 南京 210029）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一種慢性炎癥性疾病，炎癥細胞因子尤其是TNF-α在促發和維持RA的炎癥反應中扮演決定性角色。RA患者關節內，TNF-α可通過自分泌和旁分泌途徑與靶組織上特異性受體結合，經不同信號轉導途徑激活多種組織和炎性細胞，產生和分泌多種炎癥因子、黏附分子、生長因子、金屬蛋白酶、膠原酶等招募炎癥細胞的聚集和浸潤，促進滑膜血管增生、軟骨及骨損害[1]。對于RA的早期治療至關重要，抗TNF-α治療時機的選擇目前仍說法不一，本研究擬通過觀察膠原誘導關節炎模型（CIA）不同病程血清及關節局部TNF-α水平表達的變化，為TNF-α抑制劑使用最佳時機尋求依據。

1.材料與方法

1.1 材料

實驗動物：Wistar大鼠，雄性，4～6周齡，30只，體重150±20g。主要試劑：牛源性Ⅱ型膠原蛋白及不完全弗氏佐劑，美國chondrex公司產品；過氧化物酶標記的羊抗大鼠抗體（chemicon公司）；札噴酸葡胺注射液(Gd-DTPA0.05mmol/ml)購自廣州先靈公司。主要儀器：足趾容積測量YLS-7B。

1.2 模型制備[2]

Wistar大鼠適應性飼養7d后，隨機分為兩組：實驗組15只，對照組15只。分別于第0d，7d以0.5mlⅡ型膠原乳劑（終濃度為1mg/ml），分3點真皮內注射，對照組同部位注射0.05mol/L醋酸溶液0.5ml。

1.3 大鼠血清中TNF-α水平的檢測

在免疫大鼠第14d、21d以及42d，隨機抽取實驗組和對照組各5只，眼眶靜脈叢采血分離血清，-200C凍存，用ELISA方法檢測血清TNF-α水平。

1.4 大鼠關節組織病理學檢查及評分

第14d、21d以及42d，隨機抽取實驗組及對照組各5只大鼠，光鏡下觀察組織病理改變，同時進行關節病理評分。免疫組織化學方法染色雙足標本，分析TNF-α表達（陽性密度）。

1.5 統計學方法

所有數據用SPSS17.0統計軟件處理，正態分布且方差齊同的定量資料以均數±標準差表示，偏態分布資料以中位數表示，兩組間均數比較采用t檢驗或秩和檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 CIA模型

根據關節炎指數評分及左足爪容積測定，大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平測定以及大鼠關節病理，CIA成模率93.33%。

2.2 CIA大鼠血清TNF-α水平

21d、42d大鼠血清TNF-α水平明顯增高（圖1）。

圖1 不同病程CIA大鼠血清中TNF-α表達水平

2.3 CIA大鼠關節組織病理學評分

在滑膜增生病理評分上21d和42d的大鼠與14d比較有差異（P＜0.05）；在新生血管病理評分上14d和42d的大鼠與21d比較有差異（P＜0.05）；炎癥細胞病理評分上14d、21d和42d無差異。（表1）

表1 不同病程CIA大鼠關節組織病理學評分

2.4 不同病程CIA大鼠關節TNF-a表達

在光鏡下觀察CIA大鼠14d關節滑膜表面襯里層細胞、軟骨細胞及皮膚鱗狀上皮細胞，TNF-α呈彌漫弱陽性；21d關節滑膜表面襯里層細胞、軟骨細胞、滑膜炎癥細胞、血管及皮膚鱗狀上皮細胞，TNF-α呈彌漫強陽性；42d關節軟骨細胞、滑膜炎癥細胞，TNF-α呈彌漫弱陽性。Metamorph圖像分析系統，隨機5個高倍視野，計算陽性面積比（陽性密度）。21d與14d、42d的關節局部TNF-α表達有顯著差異（P＜0.05）。（圖2A-C）

圖2 A 14d大鼠滑膜襯里層細胞TNF-α彌漫弱陽性

圖2 B 21d大鼠滑膜襯里層細胞、浸潤炎癥細胞、血管壁、軟骨TNF-α彌漫強陽性

圖2 C 42d大鼠滑膜襯里層細胞TNF-α彌漫弱陽性

3.討論

TNF-α在RA發病機制中的意義：（1）可以誘導內皮細胞表達黏附分子1，促進白細胞與血管內皮黏附滲透導致局部炎癥；（2）增加滑膜、內皮細胞和成纖維細胞釋放生長因子促使血管翳的形成刺激基質金屬蛋白酶表達；（3）刺激纖維母細胞和軟骨細胞產生地諾前列酮，促進軟骨損害和膠原降解。研究表明[3][4]多數RA患者血清中、關節液中TNF-α水平升高，TNF-α水平與RF、ESR和CRP呈正相關，與IFN-γ、IL-6變化趨勢一致。TNF-α在RA炎癥的形成、血管翳增生、軟骨和骨破壞中發揮重要病理作用，通過NF-κB途徑進一步活化細胞、體液免疫，促進趨化因子、細胞因子、粘附分子表達，形成自身炎癥反應環，從而放大炎癥反應，導致關節破壞。

本實驗通過病理觀察到CIA模型受累關節滑膜有大量炎性細胞浸潤，在大鼠關節組織炎癥炎癥細胞病理評分上14d、21d和42d無差異，表明免疫初期直至成模炎癥反應持續活躍狀態。21d血清中即可檢測到高水平TNF-α，免疫42d仍持續高濃度。CIA大鼠滑膜免疫組化染色結果顯示TNF-a陽性表達在14d時開始明顯增高，21d最強。局部滑膜表達TNF-α早于血清中TNF-α，考慮TNF-α主要是由滑膜巨噬細胞產生，初始主要存在于滑膜襯里細胞層[4]。TNF-α在不同病理時期高表達的部位不同，提示其對于RA的發病機制可能存在不同。

本實驗結合CIA模型不同病程的病理學改變，發現CIA大鼠早期出現血清TNF-α水平增高及關節TNF-α表達陽性，且血清TNF-α持續高水平，在滑膜炎、血管翳增生等急性病理損傷期免疫組化TNF-α表達強陽性。基于抗TNF-α能減少RA患者滑膜TNF-α、IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白1、IL-1β、血管內皮生長因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達，能減少白細胞向炎癥關節遷移，減少或阻止關節滑膜炎的發展和骨關節的破壞，改善關節炎癥狀，結合本實驗結果，在RA炎癥反應初期，疾病早期使用TNF-α抑制劑可能療效更佳。