聚合酶鏈式反應方法檢測豆制品中轉基因成分的研究概述

孟 靜，任易婕，孫瀟慧，鐘麗霞，霍勝楠

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

1 轉基因大豆的概述

大豆作為主要的糧食作物和油品原料，不管在農業發達還是不發達地區，種植面積都占有較大的比例。早期主要依靠農藥來對抗植物病蟲害，提高產量，隨著科學技術的發展，轉基因作物發展迅猛，尤其是轉基因大豆，抗病蟲害、抗除草劑等外源基因的表達在種植方面的優勢使得大豆的種植面積和產量有了重大突破，2017年大豆產量3.34億t，這在很大程度上依賴于轉基因技術。

2017年我國大豆進口量達到9 500多萬t，占全球大豆貿易量的70%左右，已是世界第一大豆進口國。全球最大的大豆出口國—美國的轉基因大豆種植比例為95%，阿根廷、巴西幾乎全部種植轉基因大豆。所以在全球大豆貿易中，主要是轉基因大豆。國內市場大豆主要用于兩方面：一是飼料豆粕及初級加工食品原料，二是食用豆油。中國人口眾多，滿足民眾的消費需求是大豆進口的主要原因。大豆含有豐富的優質植物蛋白，可制作成深受人們喜愛的各種菜肴，除食品外，大豆還廣泛地應用于醫藥、化工等領域。楊永存等[1]調查了2012-2015年深圳市售大豆中轉基因大豆的銷售及標識情況，轉基因陽性率為6.71%。黃靖等[2]在廣州抽取的豆制品，轉基因檢出率超過50%，但在其產品上未進行有效標識。孟彥辰等[3]調查了轉基因標識制度、現狀及存在的缺陷，指出我國目前需要制定的一系列轉基相關法律制度。

我國先后發布了《中華人民共和國種子法》、《農業轉基因生物安全管理條例》、《農業轉基因生物標識管理辦法》等相關法律法規，對轉基因產品的進口、種植、使用、監管作出了明確的體系要求。進口用做加工原料的農業轉基因生物，不得改變用途，目前我國除轉基因棉花和番木瓜的種植外，沒有批準其他轉基因糧食作物種子在中國境內種植。農業部有關負責人表示，我國對轉基因工作的要求是明確的，即研究上要大膽，堅持自主創新；推廣上要慎重，做到確保安全；管理上要嚴格，堅持依法監管。2017年中央1號文件強調，要“加強農業轉基因技術研發和監管，在確保安全的基礎上慎重推廣”。

2 豆制品轉基因的檢測

目前，國內外轉基因產品檢驗方法主要有兩種，第一種是以核酸為檢測目標物的方法[4]；第二種是以特定的表達蛋白為目標物的檢測方法，包括蛋白質單向電泳、雙向電泳、Western雜交分析及酶聯免疫分析技術[5]。核酸檢測是研究最多、應用最為廣泛的，包括聚合酶鏈式反應（poly-merase chain reaction，PCR）、探針雜交法等，所有這些應用都是以從樣本中提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為整個檢測的基礎，而食品原料經過不同方式處理，成品中DNA片段的大小也不盡相同。

我國豆制品的加工工藝主要包括高溫蒸煮、磨粉成漿、壓榨、發酵抽提等，不同的加工方式對基因組的影響不同。根據對核酸的破壞和保留程度，加工方式分為初級加工和深加工，初級加工有磨粉、高溫蒸煮等，壓榨和發酵抽提則屬于深加工方式。TIAN F等[6]研究了不同溫度對豆制品中核酸的破壞程度，發現溫度越高，DNA破壞程度越大；陳穎等[7]發現物理過程（如磨漿、高溫加熱）可使DNA片段降解一半甚至更多；王超等[8-9]調查了豆粉、豆干、豆腐、豆漿和腐竹等6種產品的轉基因情況，樣品均提取到了高質量的基因組DNA，建立了穩定的實時定量熒光聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）擴增體系；王衛國等[10]研究了微波和高壓對大豆轉基因成分的影響，結果表明微波處理的樣品核酸降解比較徹底。以上實驗表明，初級的加工方式對核酸的影響不大。而壓榨、抽提等深加工方式對產品中核酸的保留程度有很大的影響，李允靜等[11]論述了植物油的轉基因成分檢測技術的研究進展，針對植物油中核酸含量低、片段短的現狀，提出了縮短檢測靶標開展食用植物油中轉基因成分檢測是今后研究的一個方向；核酸的質量是整個PCR檢測的基礎，針對深加工產品，各個研究小組也提出了不同的前處理方法來獲取高質量的DNA，SN/T 2705—2010《調味品中轉基因植物成分實時熒光PCR定性檢測方法》中對調味品的前處理采用了十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammoniumbromide，CTAB）處理和低溫差速離心的方法[12]，得到了可用于PCR檢測的DNA；程紅梅等[13]研制了離心柱法提取大豆油中DNA，可以從10mL油中提取出0.4μg DNA；欒鳳俠等[14]比較了CTAB方法及改良試劑盒方法在提取油脂中DNA的效果，推出了適用于實時熒光定量PCR擴增檢測的提取試劑盒。目前大豆油及調味品中的大豆轉基因成分的檢測做了較多的研究，劉錦鶴等[15]利用硅膜吸附柱法來富集提取大豆油中的DNA，PCR擴增后能夠得到清晰的目的基因條帶，在7個樣品中檢出了外源基因；張娟等[16]以CTAB法為基礎進行DNA提取方法的優化，所建立的方法在樣品的檢測中可以有效檢出內源基因；張文志等[17]設計了熒光定量PCR的探針來檢測醬油中外源基因，建立了逆轉錄PCR（reversetranscription PCR，RT-PCR）的方法檢測大豆成分。

這些樣品的前處理方法較為成熟，在食品安全國家標準的制定過程中，制定單位可驗證并采用這些研究成果，完善國家食品安全標準，為食品轉基因檢測及監督提供技術保障。

3 現行轉基因大豆的檢測及標準的概況

已經有眾多學者利用酶聯免疫吸附法[18-19]、色譜法[20-21]、芯片法[22-24]、光譜法[25]、核酸檢測法[5-7]等開展大豆制品的轉基因成分檢測的研究，形成國家檢測標準且應用廣泛的是核酸檢測方法，經檢索，我國已發布大豆及其制品轉基因成分檢測的方法主要有農業部公告16項，行業標準12項，農業部標準5項，轉基因檢測實驗室通用的國家標準8項、農業部公告1項、行業標準1項，另外還有部分地方標準等。檢測標準中均為定性檢測，轉基因通用的國家標準中對實驗室的布局、樣品的制備、核酸的提取和PCR體系、實驗過程的質量控制和結果的判斷表述都作了較為詳細的說明，轉基因產品檢測實驗室的建設和日常的檢測工作都應遵循這些標準。各檢測方法都有其自身的適用范圍，實驗室可根據檢測樣品及檢測環境條件進行選擇實驗，常用檢測方法的優缺點比較見表1。

表1 常用檢測方法的優缺點比較Table 1 Comparison of the advantages and disadvantages of commonly used detection methods

檢測方法標準主要是農業部的1485、1782、2031、2122、2259號公告及行業標準，內源基因選用了大豆凝集素Lectin基因，外源基因則是通過檢測耐除草劑、抗蟲和品質改良的轉化體特異序列來判斷是否含有轉基因成分（如CaMV 35S啟動子、NOS終止子等），檢測步驟包括：抽樣及樣品制備、模板的制備純化、PCR反應、產物檢測，對大豆的原料及初級加工產品的轉基因檢測來說是比較容易，且能取得很好的結果，這都源于模板DNA的獲得。植物油、調味品等由于其加工工藝的特殊性，核酸在加工過程中的降解、含量低等特點，使得DNA模板在提取過程中相當困難[39-40]，其他的深加工產品如阿膠DNA的提取也存在類似的問題[41]，同時市場上也推出了相關的試劑盒產品（如EdibleVegetable Oil DNA Extraction Kit等），研究人員對傳統方法改進后進行DNA的提取[42]，獲得很好的效果。

大豆轉基因檢測的標準中核酸的擴增檢測主要分為普通PCR、熒光定量PCR方法和環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）3種方法。普通PCR在DNA聚合酶的作用下，通過引物與模板DNA的退火延伸，目標片段得到指數擴增，使用凝膠電泳對片段的大小進行檢測，回收測序來判斷目標序列，屬于定性反應。熒光定量PCR則是在PCR的基礎上通過熒光探針或熒光染料的加入使得熒光信號的累積與PCR產物形成同步，從而使目標DNA的定量成為可能。

引物的設計是影響PCR實驗的重要因素，尤其對DNA含量少、片段小的產品（如油脂類、調味品等），引物的長短、特異性都是關鍵點，熒光定量PCR在實驗完畢后通過Ct值來判斷是否含有目標基因，較普通PCR快速方便，是我國在標準或科研中使用最多的方法，該技術在探針的設計及檢測儀器比較昂貴。環介導等溫擴增方法靈敏度高、反應時間短、不需要特殊的儀器、操作簡單，同時引物設計和前期開發較復雜，容易造成假陽性，但環介導等溫擴增反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，有著廣泛的應用前景，容易在基層檢測機構推廣，目前僅在原料的轉基因檢測方面有應用[43]。

4 討論與建議

我國按照全球公認的評價準則并結合國情，建立了涵蓋1個國務院條例、5個部門規章的法律法規體系，覆蓋轉基因研究、試驗、生產、加工、經營、進口許可審批和產品強制標識等各環節，形成了一整套適合我國國情并與國際接軌的法律法規、技術規程和管理體系，為我國農業轉基因安全管理提供了有力保障。但在轉基因檢測領域，大豆產品轉基因檢測的標準較多，檢測基因不同，相互之間存在不統一，在這里提出幾個在實驗過程中的問題，以期給現階段正在進行的標準整合工作提供一定的參考。

模板DNA濃度和純度：農業部發布的轉基因大豆檢測公告（以下簡稱“公告”）中對于模板DNA的濃度都給出了明確的說明，即PCR反應管中的終質量濃度為2mg/L，在行業標準中對DNA的濃度給定了一個范圍，在方法驗證過程中需根據儀器的檢出限等特點自行實驗。模板的濃度和純度對痕量目的基因的檢測來說是較為重要的，紫外分光光度計除給出濃度外，A260nm/A280nm的比值用于評估樣品的純度，在實驗中應對這兩點進行關注，需要質控樣品進行質量控制。

循環次數：公告中PCR反應的循環次數統一為35次，行業標準中為40次。PCR反應體系中的酶和底物在最初的循環中，快速的結合擴增，擴增曲線呈現S型，循環次數過多，產物間可能會形成較為復雜的結構，模板的特異性降低，可能會形成非特異性擴增，給后續的檢測帶來誤差，因此循環次數不是越多越好，如果Ct值為35～40，實驗人員需要重復實驗進行確認，生產加工過程中多個生產線上產品之間的交叉所帶來的痕量DNA對結果的判定存在干擾，標準制定應對此明確。

PCR產物的檢測：定性PCR方法中，產物的檢測使用了瓊脂糖凝膠電泳來分離判斷片段大小，由于樣品中殘留的核酸片段小、含量少、擴增效率不高，結果判定時比較依賴檢驗人員的經驗。熒光定量PCR和毛細管凝膠電泳的引入在很大程度上可以彌補定性檢測的缺陷，但儀器價格昂貴，很難普遍推廣，特別是基層監管機構。

標準物質的獲取：GB/T 19595.2—2004《轉基因產品檢測實驗室技術要求》中要求檢驗過程應設置實驗室環境對照、陰性質控、陽性質控和PCR抑制物對照來作為實驗室轉基因檢測體系的質量控制手段，陰性質控包括核酸提取空白對照、PCR擴增試劑對照和陰性目標DNA對照，陽性質控包括陽性提取對照、陽性目標DNA對照和弱陽性目標序列對照[31]，這里提到的陰性目標DNA對照和陽性質控都屬于標準物質，它的使用是轉基因產品檢測結果有效的重要保證。按是否需要認證分為基準標準物質、普通標準物質和工作標準物質，有證標準物質是基準標準物質，可以溯源到有證標準物質的是普通標準物質，正常使用和消耗的主要是工作標準物質。在正常監管工作中轉基因生物定性檢測主要采用工作標準物質作為陰性和陽性對照，轉基因生物定量檢測可以采用普通標準物質進行。標準物質有4種形態：種子、粉末、目標DNA和質粒，這4種形態各有優劣，市場上能夠提供的品系種類有限，大部分實驗室使用的是代代相傳的種子。目前農業部科技發展中心負責研制的標準物質已經面向市場提供，標準物質的規范化生產和監管體系的完善指日可待。

5 總結與展望

中國是轉基因生物及其制品的巨大市場，而豆制品又居于首位，隨著生物技術的迅速發展，除抗除草劑品種外，將會有更多的品種出現。轉基因產品可以增加產量，解決食品短缺問題，還可以增加食品的種類，改進食品的營養成分，增加作物的抗蟲害、耐嚴寒、抗高溫、耐鹽堿、抗倒伏的能力。同時也給轉基因生物安全監管和檢測提出了更為嚴峻的問題。為適應轉基因產品的快速發展，要構建標識和檢測標準監管體系，以統一、有效、協調、時效性為原則，開展對標準體系的評價、確認和改進，進一步完善標準體系，為保障食品安全做好技術支撐。